Pyrosequencing

احدى طرق Next Generation Sequencing لتحديد تواليات القواعد النتروجينية في DNA .تستعمل للعديد من الاغراض في مجال علوم الحياة . تختلف الطريقة عن الطرق التقليدية مثل طريقة Sanger في انها تعتمد في تحديد التواليات على عمليات التخليق للDNA اي انها Sequencing by Synthesis ،  تمتاز الطريقة بالانضباط والدقة والمرونة لذلك يكمن ان تستعمل في تحديد SNPs وكذلك قطع DNA القصيرة جدا ، ويمكن ان تحول الى شكل آلي وبعيدا عن البواديء او النيوكلوتيدات المعلمة (Labelled) . ظهرت الطريقة بداية القرن الواحد والعشرون للتغلب على بعض المصاعب التي تلاقيها الطرق التقليدية . طورت الطريقة في المعهد الملكي للتقنيات Royal Institute of Technology.
تعتمد الطريقة على استعمال نظام انزيمي مكون من اربعة انزيمات وتفاعلاتها مجملة في الاتي :

يستعمل DNA Polymerase وخاصة Klenow Fragment من بكتريا Escherichia coli وانزيمات اخرى . في البداية يمسخ DNA المعني الى اشرطة مفردة ثم تضاف المكيفات Adaptors الى الاشرطة المفردة وتثبت على مساند خاصة :

ثم يضاف محلول يحوي على احد القواعد النتروجينية الاربعة ويسمح للتفاعل بالحدوث ، وعند ارتباط القاعدة النتروجينية مع ما يقابلها من القواعد في شريط DNA تنطلق (PPi( Pyrophosphate التي تكون ذات طاقة عالية لذا تستغل وتحول الى ATP بواسطة انزيم ATP Sulfurylase المشتق من خميرة الخبز ، وبمساعدة انزيم Luciferase ( المشتق من ذبابة النار Photinus pyralis يحول Luciferin الى Oxyluciferin مطلقا الضوء الذي يسجل بمجسات خاصة عند طول موجي 560 نانومتر وتكون شدة الضوء متناسبة مع عدد جزيئات ATP .

وبعد ذلك يقوم الانزيم Apyrase المشتق من البطاطا Solanum tuberosum بتفكيك النيوكلوتيدات التي لم ترتبط .

بعد انتهاء هذا التفاعل يضاف المحلول الحاوي على قاعدة نتروجينية اخرى لتعاد دورة تفاعلات الانزيمات المذكورة آنفا ، ويحصل هذا للقواعد النتروجينية الاربعة الداخلة في تركيب DNA.
يمكن ان تتم العملية باستعمال الطور الصلب اذ تثبت الجزيئات المراد تحديد توالياتها على مساند صلبة ملائمة ، او يمكن ان تتم في الطور السائل بعد اجراء التحويرات اللازمة . ويمكن اجمال العملية بالمخطط الاتي :

وتسجل النتائج في لوحات المخرجات كالاتي :