الأغشية الحيوية Biofilms

احدى المظاهر التي تتعامل بها الاحياء المجهرية للعيش في الطبيعة والتي تختلف تماماً عن عيشها في الاوساط الغذائية المختبرية او اوساط معدة التصنيع، لذلك كان لابد من التعامل مع الموضوع لما له من اثر كبير في استخدامات الاحياء المجهرية والتعامل معها في مجالات كثيرة في التقنيات الحيوية مثل المجالات الطبية والبيئية وغيرها.

والاغشية الحيوية معروفة منذ أمد بعيد وتشير الدراسات والنظريات الى ان الاغلبية العظمى من الاحياء المجهرية تنتظم بشكل مجاميع تعيش في الأغشية الحيوية الملتصقة الى سطوح الانظمة البيئية التي توجد فيها، وان حوالي 99% من الاحياء المجهرية في البيئة تعيش في أغشية حيوية لأنها توفر لها الحماية ضد العديد من العوامل مثل المضادات الحيوية او المواد الكيماوية او العاثيات او عمليات الالتهام من قبل الجهاز المناعي او تأثير مضادات الأجسام المضادة التي يكونها المضيف.

وقد وضعت عدة تعاريف للأغشية الحيوية كلها تصب في مضمون واحد وهو وجود احياء ضمن تراكيب تحميها وهذه التراكيب قد تكون ليفية او مكوثرات سكرية ملتصقة بالسطوح الصلبة. وتكون سطوح لزجة على السطوح الصلبة في البيئة، تتجمع فيها الخلايا من نوع واحد او انواع مختلفة من الاحياء مثل البكتريا والخمائر والفطريات، التي تكون على شكل خلايا مفردة او مستعمرات صغيرة يمكن ان تنفلت منها الخلايا ولكن في العموم يكون التصاق الخلايا في الأغشية غير قابل للرجوع.

وداخل الأغشية الحيوية تختلف فعاليات الخلايا المقيمة Sessile cells عن الخلايا النامية بشكل عالق، اذ يحصل تداخل كبير بين الخلايا في الحالة الأولى بينما يكون التداخل بسيط في الحالة الثانية

الطبيعة التركيبية للأغشية الحيوية :

  تتكون من مكوثرات سالبة الشحنة وسكريات مكوثرة او غيرها من المواد ويمكن ان تحوي على مواد لا عضوية، وتكون ذات رطوبة عالية، وتلتصق الأغشية الحيوية الى السطوح الصلبة كما ذكر وكذلك مع بعضها وتحوي الاحياء المجهرية داخل الثقوب الموجودة فيها، وعملية الالتصاق تؤدي الى قدح التعبير عن الجينات التي تسيطر على عمليات تخليق الأغشية الحيوية والالتصاق، وهذه الجينات تبدأ بالعمل عند بدء التصاق الخلايا.

اين توجد الأغشية الحيوية

توجد في أغلب البيئات الطبيعية والصناعية، واكثرها أهمية التي تتولد عند الامراض، فهي يمكن ان توجد عند التهاب صمامات القلب، التهاب الاذن الوسطى، التهاب غدة البروستات البكتيري المزمن والتحوصل الليفي وكذلك حول الاسنان Dental plaques والعدسات اللاصقة عند استعمالها في العيون ويمكن ان تشغل الممرات التنفسية في مرضى التحوصل الليفي اذ تقوم Ps. aeruginosa بتكوين الأغشية الحيوية. كما توجد على الادوات الطبية مثل القثطرات Catheters التي تستعمل في مناطق مختلفة من الجسم وكذلك الادوات المستعملة في الفحص وحتى في ممرات الماء في عيادات طب الاسنان. ووجد ان البكتريا Staph . aureus , Staph . epidermidis تنتشر حول العدسات اللاصقة وكذلك توجد في الأغشية الحيوية في الفم.

تكون الأغشية الحيوية

تبدا عملية تكوين الأغشية الحيوية عند حصول عملية الالتصاق، ولذلك فانها يمكن ان تتأثر بطبيعة السطوح. واول الخطوات هو استعمار السطوح، والبكتريا يمكن ان تستعمل الاسواط او الشعيرات الجنسية للالتصاق وأنواع اخرى تعتمد على طبيعة سطوحها للالتصاق وعندما تصل اعداد الخلايا الى حد كبير تفرز جزيئات واطئة الوزن الجزيئي ضمن ظاهرة تحسس الزحام مثل AHLs وعندما يصل تركيز المواد حدا حرجا تبدأ الخلايا بتغير تصرفاتها وتبدأ بتنشيط مجموعة من الجينات المختلفة والتي تختلف من نوع الى اخر وتبدأ الخلايا بإنتاج السكريات المكوثرة الخارجية. فمثلا في البكتريا Ps. aeruginosa التي تنتج الالجينات بواسطة الانزيم Phosphomannomutase المسيطر عليه بالجين aglC، فالجين يبدأ بالتعبير عنه في الدقائق الأولى بعد عملية الالتصاق. وقد وجد ان هناك 45 جين يحصل فيها تغير عند اقامة الخلايا في الأغشية الحيوية عما هو الحال عند النمو بشكل عالق.

وبعد تكون الغشاء الحيوي يصبح التركيب له عالي اللزوجة ويكون بمثابة تراكيب مطاطية، ويلاحظ ان الأغشية المتكونة تحت ضغوط قوى رج عالية تكون قوية وصعبة التفكيك بالوسائل الآلية، اما اذا تكونت تحت ظروف معتدلة فتكون سهلة الكسر.

ويمكن دراسة الأغشية الحيوية بعدة طرق منها :

•        استعمال المجهر الالكتروني بطرقه المختلفة.

•        قياس العد العيوشي للخلايا في الغشاء الحيوي.

•        قياس المحتوى البروتيني الكلي.

•        قياس السموم الداخلية.

•        قياس ATP الكلي.

وهناك طرق اخرى يمكن ان تستعمل لدراسة الأغشية الحيوية لأغراض السريرية.

والأغشية الحيوية ليست تراكيب متجانسة او مكونة من طبقة من الخلايا الميكروبية على السطح وانما هي تراكيب متباينة تتغير باستمرار على النطاق الزمني والمكاني. والوحدات التركيبية فيها هي المستعمرات الصغيرة جدا والتي يمكن ان تتحسس الزحام وتكون مقاومة للأدوية والعوامل القاتلة ويمكن ان تنفلت منها الخلايا الى مناطق اخرى. وتحوي الأغشية كميات كافية من الماء لغرض بقاء الخلايا حية، وتشكل الخلايا الحية في الأغشية حوالي 15%، أما المواد الاخرى فتشكل 85% ، وتكون بشكل تراكيب تحوي على القنوات ليمر فيها الماء. وتكون للطبيعة التركيبية للأغشية تأثير كبير خاصة في الاصابات المزمنة وذلك لانفلات الخلايا من المستعمرات الصغيرة عند زيادة القوى المسلطة عليها حاملة معها المقاومة.

تغير فعاليات الخلايا داخل الأغشية الحيوية

تظهر الخلايا داخل الأغشية أنماطا مختلفة في فعالياتها التي تختلف عن الحالة العالقة، فتختلف معدلات نموها والتعبير عن الجينات عما هو الحال في Non - biofilm population التي تشمل مستعمرات بكتيرية او غيرها من الاحياء تنمو على سطح اكر الاوساط الغذائية، اذ لا تظهر فيها صفة المقاومة بشكل اساسي التي تظهر في الخلايا التي تعيش في الأغشية، وتكون معدلات النمو واطئة عادة ولا يمكن السيطرة عليها، وانخفاض معدلات النمو تكون مرافقة لصفة كراهية سطوح الخلايا للماء والذي يساعد على استعمار الخلايا للمواقع التي تتصل بها. وتؤدي عمليات تكوين الأغشية الى تنشيط جينات عوامل الضراوة.

المقاومة للأدوية

اهم ما يميز الخلايا داخل الأغشية الحيوية هو مقاومتها للمواد القاتلة مثل المضادات الحيوية او غيرها، كما انها تكون متوارية عن الجهاز المناعي. فالأحياء داخل الأغشية تكون مقاومة للمضادات الحيوية خاصة تلك التي تسبب اصابات مستعصية بنسبة 20 – 100 مرة بقدر الخلايا النامية بشكل عالق. ولذلك فان الطرق المعتمدة لقياس تأثير المضادات الحيوية على الاحياء المجهرية مثل طرق NCCLs والتي تعتمد على استعمال الخلايا العالقة لا يمكن ان تعطي صورة صحيحة عن كفاءة الأدوية ضد الاحياء الموجودة في الأغشية، ولهذا تم ايجاد طرق واجهزة تعتمد الى اختبار المضادات الموجودة او المثبطة في الأغشية الحيوية والتي تكون تحت تأثير العديد من العوامل.

ومن الجدير بالذكر ان طبيعة تركيب الأغشية الحيوية تؤثر في فسلجه الاحياء الموجودة فيها ومنها توارث المقاومة للمضادات بكل أنواعها، واليات المقاومة تشترك فيها عدة أطراف منها :

•        تأخر نفاذ المضادات خلال مادة الغشاء الحيوي, اي ان الأغشية تشكل حاجزا أمام انتشار المضادات.

•        تغير معادلات نمو الاحياء داخل الأغشية.

•        تغيرات فسلجيه نظراً لطبيعة النمو في الغشاء الحيوي.

ولكي تكون المضادات مؤثرة فهي يجب ان تنتشر خلال مادة الغشاء الحيوي لتصل الى الخلايا الموجودة فيه وتثبطها، فمثلا تأثير Ciprofloxacin على Ps. aeruginosa يحتاج الى 40 ثانية للوصول الى الخلايا العالقة، في حين يحتاج الى 21 دقيقة للوصول الى الخلايا الموجودة داخل الأغشية الحيوية. كما ان الخلايا العالقة من البكتريا نفسها تكون حساسة للـ Tobramycin بحوالي 15 مرة أكثر من الخلايا الموجودة داخل الأغشية الحيوية. وكذلك الحال مع البكتريا Staph epidermidis . ومن جهة ثانية قد يكون معدل الانتشار ليس هو السبب الوحيد فمضادات اللاكتام و Aminoglycosides تنتشر بسهولة ولكنها تتفاعل مع المواد المكونة للأغشية الحيوية مثل الالجينات لذلك وبعد حصول التشبع تبدا بالانتشار والتأثير الذي يحتاج الى وقت طويل يمتد الى 80 – 100 دقيقة

ومن أكثر المؤشرات تأثرا هو معدل النمو، وذلك لان الخلايا في حالة وجودها داخل الأغشية تكون في حالة نمو غير متزامن بشكل كبير فبناءا عليه فان أنزيماتها تكون ذات علاقة مختلفة ويمكن ان تكون :

•   انزيمات فعالة على طول دورة حياة الخلية.

•  بعض الانزيمات تتضاعف كمياتها او فعالياتها عند مراحل معينة من الانقسام وهذه تفكيكها يعتمد على الرقم الهيدروجيني والحرارة ولا تكاد تكون ذات علاقة مع معدلات النمو.

•  بعض الانزيمات تكون متناسبة مع الكتلة الحيوية.

•   بعض الانزيمات تخلق بشكل دوري اعتمادا على المرحلة من دورة الخلية.

لذلك يكون تأثير الادوية متغايرا في المزارع غير المتزامنة. مثلا الادوية التي تؤثر على DNA تكون فعالة في الخلايا التي يحصل فيها تضاعف ولذا فان جزءا كبيرا يكون مقاوما لها، كما ان تأثير مضادات للاكتام B- lactam يزداد بزيادة معدلات النمو، اما في المزارع المتزامنة يلاحظ ان الخلايا تكون حساسة عند الانقسام وتصبح مقاومة في المراحل الاخيرة من الانقسام ودورة الخلية. كما ان بطيء النمو يؤدي الى بطيء قبط المواد أيضاً ولذلك كانت المقاومة عكسية مع معدل النمو.

اما الحالة الفسلجية للخلايا في الأغشية والتي تكون تحت ظروف اجهاد متعددة منها قلة المواد الغذائية ووجود المواد السامة وتغير كثير من الظروف فتكون متغيرة، فقد وجد ان E . coli  المقتنصة داخل الاكر تكون أكثر مقاومة للمضادات نظراً لقلة الاوكسجين، اي ان الخلايا تحت اجهاد قلة الاوكسجين. كما ان ارتباط الخلايا وانطمارها في الأغشية الحيوية يؤدي الى كبح عدد من الجينات ومن ناحية ثانية تنشط فعاليات جينات اخرى تؤثر على فسلجه الخلايا وبالتالي على المقاومة.

وربما كانت آلية انخفاض معدلات النمو الاكثر تأثيراً، والذي يجعل الخلايا متحملة هو تأثير الجين relA الذي يحبط عمليات الموت المبرمج في الخلايا. وفي مجتمعات الأغشية الحيوية تظهر المثابرات Presistors والتي هي ضروب من النمط الطبيعي وليست طفرات. فعند اضافة المضادات الى الخلايا في الأغشية الحيوية يحصل قتل بنسبة 100 – 1000 مرة عند نقطة البدء والباقي لا تموت حتى عند زيادة تركيز المادة القاتلة وهذا ما لوحظ عند استعمال عددا من الأدوية ومع أجناس بكتيرية مختلفة، اذن دائماً يوجد قتل اولي كبير يتبعه ظهور مستوى ثابت من عدد الخلايا المقاومة، وهذا يشير الى زيادة المثابرات في حالة الأغشية الحيوية، في حين تكون أعدادها قليلة في المجتمعات العالقة او الهائمة والتي يمكن ان يقضى عليها من قبل الجهاز المناعي في الجسم وبذلك فهي لا تشكل مشكلة سريرية الا في حالة الاشخاص معلولي المناعة، وانخفاض قابلية الجهاز المناعي على التهام الاعداد الباقية من الخلايا هي وراء تحديد MBC وهو تركيز المضاد الذي يؤدي الى تخفيض الاعداد بنسبة اكبر من او مساويا 9.99%. اما في حالة الأغشية الحيوية والتي تكون بعيدة عن الجهاز المناعي فانها تكون السبب في عودة نمو الاحياء بعد انخفاض تركيز المضاد او عندما يتوقف العلاج او يقطع اعتمادا على غياب اعراض الاصابة المظهرية.

اضافة الى ان الخلايا المثابرة في الأغشية الحيوية تقوم بالتهام المضادات الحيوية المضافة، كما ان الأغشية ربما لا تؤدي الى زيادة اعداد الخلايا المثابرة مقارنة بوجودها في النمو العالق للخلايا ولكن تبقى مقاومتها تنبع من بقاءها بعيدة عن الجهاز المناعي.

ان وجود الضروب المثابرة مهمة بالنسبة للبكتريا سواء عند نموها بشكل عالق او داخل الأغشية الحيوية وبقاء هذه الخلايا في الحالتين يؤدي الى :

1.   حث استجابات الاجهاد او الكرب مثل حث استجابة الاستغاثة SOS واستجابة الصدمة الحرارية والاجهاد التأكسدي وغيرها .

2.  الآلية الوراثية مثل ظهور طفرات مقاومة او اكتساب جينات غريبة تحصل عناصر المقاومة.

3.  في حالات التغيرات المفاجئة والسريعة فان الوقت لا يسمح للتعبير وحث الاستجابات وبالتالي ستموت معظم الخلايا ولكن وجود المثابرات لا يحتاج الى وقت لتطوير المقاومة ويمكن ان تبقى حية عند حدوث تغيرات مفاجئة. كما ان وجود المثابرات يكون بمعدلات عالية مقارنة بحدوث الطفرات فهي تصل الى 10 – 10000 مرة أكثر من حدوث الطفرات.

حصول المقاومة للمضادات الحيوية التي أصبحت مشكلة سريرية، والمثابرات وخاصة الموجودة في الأغشية الحيوية وقد تكون مراحل وسطية مهمة لتتطور المقاومة.

علاقة الأغشية الحيوية بالأمراض

يكون للأغشية الحيوية علاقة بالأمراض الناتجة عن الاصابات والتي تكون أكثر خطورة في الاشخاص معلولي المناعة والتي تتطور ببطء محدثة اعراض بسيطة تكون مستودع لإصابات خطيرة ويكون ذلك متعلقا بإحدى آليات الآتية :

•  انفلات خلايا من تجمعات الأغشية الحيوية الموجودة على الادوات والوسائل الطبية مؤدية الى امراض مختلفة في اجهزة الجسم.

•   انتاج السموم الداخلية.

•   المقاومة للجهاز المناعي.

•   تهيئة بيئة ملائمة لتكاثر الخلايا وحصول تبادل البلازميدات والعناصر الوراثية الاخرى.

ففي الحالة الأولى فان الخلايا يمكنها الانفلات من الأغشية نتيجة التكاثر والانقسام التي تحدث ببطيء ويمكن ان تهرب مجموعة من الخلايا، فزيادة قوى القس والرج على الأغشية يؤدي الى تآكلها وانفلات الخلايا منها، كما ان انتاج الخلايا للـ AHLs فهو بالإضافة الى انه يشارك في بناء الأغشية الحيوية الا انه يساعد أيضاً في انفلات الخلايا، والخلايا الهاربة يمكن ان تسبب اصابة جديدة او اصابة في مكان آخر.

وفي الحالة الثانية فان الخلايا السالبة لصبغة كرام الموجودة في الأغشية تنتج السموم الداخلية وتؤدي الى حث الاستجابة المناعية للمرضى.

ومقاومة الجهاز المناعي تعد احد جوانب الامراضية لوجود الأغشية الحيوية فمثلا الطبقة الخارجية المخاطية للبكتريا Staph . epidermidis تتداخل مع عملية الابتلاع من قبل الخلايا المبتلعة الكبيرة  Macrophages وان Opsonic antibodies في حالة التحوصل الليفي تفشل في التوسط في عملية الابتلاع والتخلص من البكتريا المطمورة داخل الغشاء الحيوي. كما ان خلايا الأغشية الحيوية تكون مقاومة للقتل بمركبات الاوكسجين الفعالة المنتجة من قبل Polymorphonuclear leukocytes.

وفي داخل الأغشية الحيوية تتبادل الخلايا البلازميدات ومنها بلازميدات المقاومة ويساعد في عملية الاقتران القرب المكاني للمستعمرات الصغيرة الموجودة داخل الأغشية الحيوية والذي يكون أكثر من كون الخلايا نامية بشكل عالق. ففي البكتريا Pseudomonas وجد ان معدل الاقتران يكون 2-10 في الأغشية الحيوية اما في حالة النمو بشكل عالق فيكون معدل الاقتران 7-10 وهذا ما يفسر انتشار الاحياء المقاومة في المستشفيات. وحالات الاقتران هذه تحصل في الأغشية المجردة في الفم.

اما في البيئة الموجودة فيها الخلايا داخل الأغشية فتكون مقاومة للمعادن الثقيلة مثل الفضة والنحاس وغيرها، وتوجد العديد من الاحياء التي تغطي سطوح المعادن وهذه تستغل في العمليات البيئية المتعلقة بالمعادن الثقيلة وتعدينها .

والأدوات الطبية المصنوعة من المعادن يمكن ان تغطى بالأغشية الحيوية ولذلك فالمحاولات جارية للتلاعب بنوعية المعادن وانتاج ادوات وأنابيب ذات مواصفات خاصة لا تسمح بتكوين الأغشية الحيوية، وذلك لان عمليات التعقيم والتنظيف أصبحت غير مجدية وأخيرا تم التركيز على استعمال المواد القاتلة المؤكسدة والتنظيف الآلي. ويمكن ان تثمر هذه الجهود فيما اذا اقرنت بوسائل اخرى ومنها :

•        منع تلوث الأدوات.

•        منع التصاق الخلايا الميكروبية الأول للأدوات.

•        ايجاد مواد تنفذ داخل الأغشية وتقتل الخلايا.

•        التخلص من الادوات الملوثة او الاعتماد على وسائل تستعمل لمرة واحدة.

وقد استعملت وسائل اخرى منها استعمال الامواج فوق الصوتية Ultrasonic ، واستعمال الانزيمات مثل استعمال Alginate lyase لتفكيك الالجينات والسماح للمضادات بالنفاذ والوصول الى الخلايا الموجودة فيها.

ومن الامكانيات الاخرى التي يمكن استغلالها AHLs الذي يشارك في بناء الأغشية الحيوية وكذلك انفلات الخلايا منها. وهو احد مكونات تحسس الزحام وذلك بأحداث اضطراب في نظام تحسس الزحام. كما يمكن تشخيص الجينات العاملة لتخليق الأغشية خاصة في البداية ومنع انتساخها وبالتالي منع تكوين الأغشية اي التعرف على الأغشية الحيوية على المستوى الوراثي. ولذلك فعند ظهور الاصابات عصية العلاج بالمضادات الحيوية وعصية على دفاعات الجسم، لابد من النظر الى الناحية الوراثية. وعند تطوير لقاحات للممرضات العصية يجب استعمال النمط المظهري للخلايا الموجودة في الأغشية الحيوية واستعمالها عند تطوير مضادات حيوية جديدة.

ومن التراكيب الاخرى التي توجد فيها الخلايا هي التراكيب الصفائحية Lamina وهي تراكيب تحتوي صف من الخلايا، والقديمة منها تحتوي على صفين او أكثر من الخلايا التي توجد بينها كميات كبيرة من المواد الرابطة وتكون الخلايا مرتبة بشكل عمودي. وهذه التراكيب لا تلتصق بالزجاج او السطوح البلاستيكية وانما تستقر في قعر الدوارق او تطفو عندما تكون الدوارق مهزوزة.

اما الجيوب Packets فتكون على شكل تراكيب كروية وتطمر داخلها الخلايا وتكون حاوية على المواد المالئة ويصل قطرها الى 10 خلية او أكثر وتكون مقاومة للتدمير الآلي او العوامل الكيماوية ولا تسمح بمرور المضادات الحيوية لتصل الى الخلايا، وربما كانت هذه التراكيب مهمة لتأقلم الخلايا مع البيئات القاسية، ويمكن استعمال الهندسة الوراثية لغرض تغيير التركيب التي تتجمع فيها الخلايا لاستعمالها في المفاعلات الحيوية التي يكون الجريان فيها سريع، او التي يحدث فيها تذبذب كبير في الظروف مثل الحرارة والأرقام الهيدروجينية لتوفير وسائل تساعد في زيادة انتاجية التصنيع الحيوية.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .