مكونات بيئات النمو المستعملة في زراعة الأنسجة (المواد المصلبة للبيئة)

يمكن أن تنمو الأنسجة النباتية في بيئة سائلة بشرط توفير الأكسجين الضروري للنمو وبدون الحاجة إلى سطح صلب لتدعيم النمو في أغراض معينة. وربما تنمو الأشطاء عند استعمال طبقة رقيقة من البيئة السائلة دون الحاجة إلى تهوية. فقد أمكن الحصول على عدد هائل من أشطاء Ruta graveolens يصل وزنها الطازج إلى 100 جم خلال شهر من زراعة 2 جم من الأشطاء حديثة التكشف في 20 مل من بيئة MS على أن تجدد البيئة كل أسبوع (الشكل التالي).

لكن هناك بعض المميزات التي تتطلب وجود سطح شبه صلب لتدعيم النمو، أو استعمال الوسط الصلب والسائل معا والتي سيتم مناقشتها في الباب الرابع من هذا الكتاب. وفي البداية حاول البعض تدعيم نمو الكالس والأفرع على ورق سلوفان، وورق ترشيح، وأنسجة قماش وكرات من الزجاج ، ثم استخدمت مواد تعمل على تصلب البيئة فتدعم النمو دون إعاقة نمو الجذور . ولابد أن تكون المواد المستعملة قابلة للتعقيم وأن تظل البيئة سائلة وهي ساخنة حتى يمكن صبها لتتجمد بعد التبريد. وهناك العديد من المواد التي يمكن استعمالها لهذا الغرض لكن يتوقف ذلك على العامل الاقتصادي والهدف من الزراعة فعلى الرغم أن الآجاروز غالى الثمن جداً إلا أنه أفضل تلك المواد لزراعة البروتوبلاست ومن هذه المواد ما يلي:

شكل يبين: الأشطاء المتكشفة من زراعة أوراق نباتات Ruta Graveolens في بيئة سائلة وبدون الحاجة لنظام تهوية أو رج.

1. الآجار Agar

وهو منتج طبيعي يتكون من خليط من الكربوهيدرات المشتملة على عديد من السكريات البسيطة ويتم استخلاصه من عدة أنواع من الطحالب الحمراء التابعة لأجناس Gelidium و Gracillaria و Perocladia النامية في مياه البحار، لكن يلزم تنقيته بعناية حتى لا يحتوى على مواد سامة. ويعتبر الآجار من الناحية الغذائية خاملا لكنه قد يحتوي على بعض الآثار من العناصر المغذية، والتي تختلف نسبتها تبعاً لنوع الطحالب ومكان نموها وفترة جمعها وطريقة الاستخلاص. كما تختلف نسبة الشوائب ا باختلاف نوع الآجار، ويوضح جدول رقم (1) تركيز الشوائب في بعض أنواع الآجار شائعة الاستخدام في زراعة الأنسجة. هذا بالإضافة إلى إشارة المنتج إلى وجود بعض الشوائب الأخرى مثل الماغنسيوم والمنجنيز والكادميوم، والنحاس، والكروم، والحديد والرصاص، والنيكل، والسلفات وغيرها حيث تحتوي الأنواع الردنية على مواد فينولية وربما بعض السلاسل الطويلة للأحماض الدهنية. وقد يصل معدل بعض هذه الشوائب إلى أكثر من 20 % من تركيزها في بيئة MS.

ويعتبر عدم احتواء الأجار على مواد سامة مثبطة للنمو محل شك. ونظرا لارتفاع الوزن الجزئي للآجار فإن له قدرة عالية على تصلب البيئة لارتباطه الشديد بجزيئات الماء. كما أنه يمتص بعض المركبات من مكونات البيئة والمركبات الأخرى الناتجة من عمليات الأيض النباتي. وإذا زاد تركيز الآجار عن 10% يكون من الصعب على النبات امتصاص المحلول المغذى من البيئة، حيث تكون قوة ارتباط الماء بالأجار أعلى من قدرة النسيج على الامتصاص. أما التركيز الأمثل فهو يضمن تدعيم الأنسجة المنزرعة والنباتات وتحرك المحلول من البيئة للنسيج أو النباتات المنزرعة.

جدول 1: النسبة المئوية للشوائب ببعض أنواع الآجار المستعملة في زراعة الأنسجة (1987 ,Pierik).

ومن الثابت أن الآجار يدمص بعض العناصر على سطحه لكن ليس من المؤكد حتى الآن ما إذا كان لذلك تأثير على استجابة المُستأصَل النباتي أم لا Leifert et al 1995. وغالباً يستعمل الآجار المعروف Difice Bacto agar بتركيز 0.6-0.8%، كما يكثر استعمال أنواع أخرى مثل Gibco Phytagar و Sigmas, Flow agar ، لكن ينصح باستعمال الأجاروز بدلا من الآجار عند زراعة البروتوبلاست. ومن مميزات الأجار كمصلب للبيئة:

1. تتصلب البيئة المحتوية على الآجار عند أقل من 45م وتتحول إلى الحالة السائلة برفع الحرارة مرة أخرى إلى 100 م تقريباً.

2. لا يتم تحلله بالإنزيمات المفرزة من النبات.

3. نادراً ما يتفاعل مع باقي مكونات البيئة.

ويختلف تأثير الآجار باختلاف نوعه فقد وجدت فروق ميكروسكوبية في تكشف قصيبات الخشب لكالوس الخس باختلاف نوع الآجار ، لكن لم يكن هناك فرق في عدد القصيبات المتكشفة عند استعمال Flow agar أو Gibco Phytagar أما عند استعمال النوع KC-TC زاد عدد القصيبات المتكونة. وكان هناك نقص في عدد القصيبات باستعمال الأجاروز FMC. وقارن (1998) Scholten & Peril تأثير سبعة أنواع من الآجار على الإكثار الدقيق لأحد هجن الورد Rosa hybrida باستعمال العقد الساقية وتوضح النتائج بجدول رقم (2) الفروق المعنوية في وزن وطول الأفرع وكذلك عدد ووزن الجذور المتكشفة. وبالرغم من أن النوع BD purified أنتج أعلى وزن من الأشطاء مقارنة مع باقي الأنواع إلا أن وزن وعدد الجذور كان أقل مقارنة مع باقي الأنواع المختبرة. كما اختلفت حساسية الأنواع لنوع الآجار باختلاف مراحل النمو والتكشف (جدول رقم 3) . ويستعمل الأجار غالباً بتركيز 6-8 جم/لتر حسب نوعه الآجار المستخدم، وهذا التركيز يضمن صلابة البيئة والاتصال الجيد بين المستأصل النباتي والبيئة. وبذلك يمكن تناول الأوعية المحتوية على هذا التركيز والمستعملة للزراعة دون ملاحظة سيولة البيئة، ووضع الأنسجة النباتية على سطحها دون أن تغوص فيها مع ضمان غرسها برفق لنضمن تلامس جيد بين المستأصل النباتي والبيئة. وعند إضافة الأجار بتركيز 10 جم/ لتر تكون البيئة شديدة الصلابة ويصعب وضع النسيج عليها وبزيادة صلابة البيئة يثبط نمو الكالس لكن قد يحفز ذلك التكشف لزيادة الجهد الاسموزي للبيئة، وربما يقلل زيادة تركيز الآجار حتى 12% من مشكلة التميز الزجاجي.

وبالإضافة إلى تأثير تركيز الأجار على صلابة البيئة فإن البيئة التي تحتوي على تركيز أقل من الأملاح تكون أكثر صلابة من تلك المحتوية على تركيز أعلى (1991,Ziv). كما يؤدى انخفاض الرقم الهيدروجيني إلى 4.5 لجعل البيئة أقل صلابة.

جدول 2: تأثير استعمال سبعة أنواع من الأجار على نمو الأشطاء والجذور من العقد الساقية لصنف الورد Motrea كما سجلها (1998) Scholten & Pieri.

ومن الصفات الطبيعية الهامة التي تتصف بها البيئة المضاف إليها الآجار، تقليل معدل انتشار الجزئيات المختلفة حيث يعاق انتشار الجزيئات كبيرة الحجم نتيجة تصلب الآجار ويقل الجهد المائي وتزيد لزوجة البيئة. ويعتقد أن هذا يعمل على تراكم نواتج عمليات الأيض السامة في الأنسجة المنزرعة، ويقلل تيسر مكونات البيئة المختلفة كالأيونات والهرمونات والعناصر الغذائية والمكونات الأخرى، لتناسب ذلك مع حركة الماء من البيئة إلى النسيج. علاوة على أن المُستأصل النباتي في البيئة السائلة يكون كله متصل بالبيئة أما في حاله البيئة الصلبة فإن نصف النسيج المنزرع فقط أو أقل من النصف يكون متصلاً بالبيئة، ويتمكن الجزء العلوي فقط من النسيج المنزرع من الحصول على الأكسجين.

ومن البديهي أن الضغط الاسموزي للأنسجة المنزرعة في بيئة صلبة اقل من تلك المنزرعة في وسط، سائل ليمكنها من امتصاص الماء من البيئة. ويلاحظ أن البرولين يتراكم في الخلايا المنزرعة في بيئة متصلبة مما يشجع التكشف في بعض الحالات. أما من الناحية الاقتصادية فإن الأجار يعتبر من المكونات مرتفعة الثمن والتي تسبب زيادة تكاليف البيئة وبالتالي الإكثار الدقيق. ويوضح (2002) Jain & Barbbar في جدول رقم (4) مقارنة بين تكاليف استعمال الأجار وبعض البدائل الأخرى، ويتبين من هذه المقارنة أهمية دراسة تأثير تلك البدائل على إكثار النباتات المختلفة خاصة في المجال التجاري.

2. الآجاروز Agarose

يصنع الآجاروز من الآجار، فهو عبارة عن مواد عديدة التسكر. ويندر استعماله في مزارع الأنسجة نظرا لسعره المرتفع ويرجع ذلك إلى عملية تنقيته. لكنه يعطى قوام هلامي أكثر صلابة من الأجار ولذا يستعمل بتركيز منخفض في حدود 0.4%. ومن الناحية العملية لا يستعمل في زراعة الأنسجة إلا في حالات قليلة كزراعة البروتوبلاست والمتوك. ويمتاز الأجاروز بتجمده عند درجات حرارة منخفضة 30 م تقريباً مما يجعله افضل لزراعة البروتوبلاست بالمقارنة مع البيئة السائلةBolandi et al (1999)  حيث يتم وضع معلق البروتوبلاست في طبق بترى في شكل قطرات حجمها 50 ميكروليتر ثم تصب طبقة رقيقة من البيئة ،فوقها، وبهذه الطريقة يمكن زراعة البروتوبلاست بكثافة منخفضة.

جدول 3: حساسية عدة أنواع نباتية للأجار أثناء الإكثار الدقيق Pierik & Scholten 1998).

(1) ads: أشطاء عرضية adb: بصيلات عرضية، adr: جذور عرضية، axs: أفرع جانبية.

(2) +: حساس، -: غير حساس، a: الطول، :b الوزن، c : عدد الأشطاء/ الجذور /البصيلات حديثة التكوين d % للتكشف.

3. الجل رايت Gelrite

يوجد الجل رايت تحت أسماء تجارية مختلفة مثل الفيتا جل ويعتبر من مواد التصلب عالية النقاوة وهو يتكون من مواد مختلفة عديدة التسكر ويتم استخلاصه من بكتريا Pseudomonas eleodeo حيث تمثل تلك السكريات تركيب الكبسولة الخارجية. وتحتوي الأنواع التجارية منه على شوائب البوتاسيوم، الصوديوم، الكالسيوم، الماغنسيوم، ولكن لا يحتوي على الشوائب العضوية الموجودة في الأجار. وعند تسخين 0.1% من الجل رايت على درجة حرارة 30 - 35 م في وجود أيونات البوتاسيوم أو الكالسيوم أو الماغنسيوم فإن الوسط يتصلب. ويستعمل الجل رايت بتركيز أقل من تركيز الآجار (غالباً لا يتعدى 0.2 %) ، حيث يعطى هذا التركيز قوام مشابه لتركيز 0.7 % من الآجار. وامتصاص الجل رايت للماء أقل من الآجار لذا فإن انتشار الماء والمواد الذائبة في البيئة أفضل علاوة على شفافية البيئة مقارنة مع الآجار مما يجعل الكشف عن التلوث الميكروبي أسهل. وتشير الشركات المنتجة إلى عدم احتواء الجل رايت على مواد سامة كالمركبات عديدة الفينول. ونظراً لرخص ثمن الجل رايت ونجاح استخدامه في عدة أنواع من مزارع الأنسجة ولأغراض مختلفة فإنه قد يحل محل الآجار في زراعة الأنسجة (1993 George). وقد أدى استعمال خليط من الجل رايت إلى التغلب على ظاهرة التميؤ الزجاجي الشائعة في زراعة أنسجة بعض الأشجار.

4. الألجينيت Alginate

يستخلص الألجينيت من حامض Alginic وهو عبارة عن heteropolymer يخلق في أجناس مختلفة من الطحالب البنية. وتم استخدامه بنجاح في زراعة البروتوبلاست بديلا عن الأجاروز حيث يتم التصلب بإضافة أيونات الكالسيوم، ويكون القوام الهلامي المتكون ثابت تحت درجة الحرارة العادية مما يتيح خلط البروتوبلاست مع البيئة. ويفضل استعمال الألجينيت عن الآجار لأن الآجار يتجمد على درجة حرارة 45 م. ويمكن اذابة القوام الهلامي المتكون بإضافة اسيتات الصوديوم وبذلك يتحرر البروتوبلاست. اما عيوب استعمال الالجينيت فتتمثل في تاثره بالتعقيم الحراري وتكسير جزء كبير منه لذا يعقم على 90 م ولمدة 20 دقيقة فقط. والمشكلة الأخرى التي تعيق من استعمال الالجينيت هي تفاعله مع الكاتيونات المتاينة مما يقلل من تيسرها في البيئة.

جدول 4: مقارنة تكاليف بعض المواد المصلبة للبيئة المستعملة في زراعة الانسجة (2002) Jain & Barbbar.

5. النشا

يعتبر النشا من أرخص المواد المستعملة في تصلب البيئة لكن ليس من المتوقع أن يصبح بديلاً للآجار، ويرجع ذلك إلى ضعف صلابة القوام الهلامي المتكون وكونه غير رائق مما يعيق اكتشاف تلوث المزرعة بالبكتيريا. أضف إلى ذلك إمكانية تحلله بالإنزيمات المخلقة في الأنسجة المنزرعة، علاوة على ذلك لوحظ أن صلابة القوام الهلامي المتكون تقل بعد التحضير حتى بدون تحضين أنسجة على البيئة. ومن الناحية العملية يتم مزج النشا مع أحجام صغيرة من البيئة أي ما يعادل 10% تقريباً من حجمها على درجة الحرارة العادية ثم تضاف هذه الكمية إلى باقي البيئة على درجة الغليان ويتم الخلط والصب بسرعة قبل التجمد . وأثناء التعقيم يتحلل جزء من النشا إلى سكريات يكون لها بالطبع تأثير على استجابة النسيج. فقد وجد أن معدل تكوين النباتات من متك الشعير المنزرع في بيئة تحتوي 5% من نشا الذرة أعلى من تلك المتكونة في بيئة تحتوى على أجار. وعندما استخدم النشا بدلاً من الآجار لتصلب البيئة المستخدمة لزراعة أجزاء من درنات البطاطس تكشفت الأفرع بعد 3 أسابيع فقط في حين حدث التكشف بعد 5-14 أسبوع باستخدام الآجار.

ولما كان النشا يكون سطحاً قليل الصلابة فإنه يفضل أن يغطى بطبقة من البولي استر حتى لا يغوص الجزء المنزرع به أو يتم إضافة نسب من مواد مصلبة أخرى كالآجار ، الجيل رايت أو الصمغ العربي. ويستعمل النشا عادة بتركيز 7% أو أعلى حتى يعطى سطحاً ثابتاً وقد يصل التركيز إلى 12%، وقد استعمل هذا التركيز في زراعة القمم النامية لنباتات Nephrolrpis exaltata لكنه غير مستحب. واستطاع (2001) Kodym & Zapata أن يستبدلا الجل رايت بخليط منه مع النشا ومن البدائل الأخرى الدقيق ودقيق السامولينا ونشا البطاطس ودقيق الأرز وضح .Prakash et al (2003) في جدول رقم (15) أن خليط من بدائل الآجار كان أفضل من الآجار في إكثار Zingiber officinale. كما أن استعمال خليط نشا الذرة بتركيزات منخفضة (50 جم/ لتر) مع الجل رايت (0.5 جم/لتر) في بيئة إكثار اشجار التفاح والموز وكذلك قصب السكر أفضل من استعمال الأجار. لكن كان من الصعب اكتشاف تلوث البيئة نظرا لأن لون البيئة يميل إلى اللون الرمادي ومن مميزات استعمال البدائل المشار إليها خفض تكاليف البيئة بنسبة عالية لكن قد تسبب هذه المكونات تثبيطا للنمو (Powell & Uhrig, 1987).

قام (2001) Naik & Sarkar باستعمال أحد منتجات النشا يطلق عليها Sago وهو منتج غذائي يصنع من أحد أنواع النخيل المسمى بهذا الاسم، أو من مصادر أخرى مثل نشا الأرز أو الذرة أو البطاطس ولكن هناك فروق في درجة الشفافية لهذا المنتج حسب مصدر النشا المستعمل. وقام الباحثان باستعماله كمادة مصلبة للبيئة المستعملة لإكثار عدد من الطرز الوراثية للبطاطس أو لحفظ النباتات الناتجة عند الحد الأدنى للنمو. ولم تكن التركيزات الأقل من 80 جم/لتر فعالة لإعطاء درجة التصلب المناسبة للبيئة أي التي تمنع غوص الأجزاء المنزرعة. وتشير النتائج الموضحة في جدول رقم (6) إلى عدم وجود فروق بين استعمال الأجار أو الساجو في معظم الصفات في مرحلة الإكثار مع وجود تداخل بين نوع مادة التصلب والطرز الوراثية. وكان هناك ميزة في استعمال الساجو بالمقارنة مع الآجار في حالة كون الهدف إبطاء النمو للحد الأدنى بسبب زيادة الضغط الاسموزي للبيئة بسبب تحلل جزء منه إلى سكر أثناء التعقيم. ولعل الميزة الواضحة من استعمال النشا والساجو هو عدم نقص درجة التصلب حتى بعد شهرين من الزراعة. كما أن تكاليف استعمال الساجو منخفضة جداً بالمقارنة بالآجار حيث يبلغ ثمن الكيلوجرام حوالي 0.35 دولار امريكي.

ولاحظ (2010) Mohamed & Alsadon نجاح إكثار نباتات البطاطس بالعقل الساقية باستعمال النشا التجاري للبطاطس أو الذرة بدون تأثير على ارتفاع النباتات مع زيادة عدد الأفرع عند استعمال 1 جم/لتر من الأجار و 50 أو 60 جم/لتر من النشا. وقد انخفض الرقم الهيدروجيني للبيئات التي استعمل فيها النشا بتركيز 50 أو 60 جم/ لتر من النشا. وقد انخفض الرقم الهيدروجيني للبيئات التي استعمل فيها النشا بتركيز 50 أو 60 جم/لتر، لزيادة قدرة النباتات على امتصاص الأيونات من البيئة نظراً لعدم تغيير مواصفتها الطبيعية وصاحب ذلك ارتفاع في توصيلها الكهربي.

جدول 5: تأثير بدائل الآجار على تصلب البيئات المستعملة في زراعة أنسجة وجدها (2001) Naik & Sarkar.

6. الصمغ

وهو من المركبات الطبيعية عديدة التسكر التي تخلق في الكثير من الأنواع النباتية. ويمتاز الصمغ عموماً بقدرته على زيادة لزوجة الماء حتى عند استعماله بتركيزات منخفضة نسبيا، حيث يتشرب بالماء وينتفخ مكونا قواماً اسفنجياً شفافاً. ويستخلص الصمغ من بعض النباتات كأشجار الصمغ العربي والعشبيات مثل Cyamopsis tetragonolobus وهو من المصادر الطبيعية لصمغ Galactomannans والذى يتركب من المانوز والجلاكتوز بنسبة 1.6 - 1 . ويعتبر الجلاكتوماننانز ثاني أكبر مجموعة سكريات متعددة تستخدم في تخزين السكريات في النباتات. ويشجع السعر الرخيص لهذا المنتج وقدرته على تصلب البيئة على استعماله كبديل للآجار. وقد استعمل (2006) .Lueyszyn et al خليط من الجلاكتوماننز المستخلص من نباتات Cassia fastuosa و C. tetragonolobus والآجار بمعدل 3 و 0.3 % على التوالي لإكثار نباتات الفراولة. واظهرت دراسة الخواص الطبيعية للبيئة تأثير جيد للخليط، كذلك كان نمو الأشطاء والجذور أفضل بالمقارنة مع استعمال الأجار بمفرده.

ومن أنواع الصمغ التي استعملت لتصلب البيئات في مزارع الأنسجة صمغ الكاترا Katira Gum وهو مادة عديدة التسكر غير ذائبة تحتوى على 50% بنتوز وجلاكتوز تفرز من لحاء أشجار Cochlospermum religiosum وهو شبيه بالصمغ العربي المفرز من أشجار Acaccia arabica وله عدة استعمالات صناعية ودوائية. وبالتحلل المائي في وجود أيونات المعادن ينتج 14% حامض الخليك وحامض الجوندك والزيلوز والجلاكتوز و α-cochlospermic. وتم استخدام صمغ الكاترا بنجاح للحصول على بيئة شبه صلبة صالحة لتكوين الأشطاء والجذور والأجنة الجسدية ويوضح جدول رقم (7) مقارنة بين استعمال صمغ الكاترا والأجار على تكوين الكالس والجذور في نباتات Syzgium cuminii وتكوين الأجنة الجسدية في نباتات Albizzia lebeck كما أوضحها (2002) Jain & Barbbar . حيث يتضح من النتائج عدم وجود فروق بين كلا المادتين.

جدول 6: تأثير الآجار والساجو على الإكثار الدقيق لبعض الطرز الوراثية من نباتات البطاطس (Naik & Sarkar2001).

وتم أيضا الحصول على القوام الصلب للبيئة باستعمال خليط من الصمغ بنسبة تتراوح بين 1 و 3 % مع الآجار بنسبة 0.2-0.6% وتوضح نتائج Jain & Barbbar (2002) في جدول رقم (8) أثر هذا الخليط على لزوجة البيئة وتكوين الأشطاء والجذور في S. cuminii . وأشجار Albizzia lebec جدول رقم (9). وكانت لزوجة البيئة المحتوية على تركيز 3% من الصمغ تعادل 18 % من تلك المحتوية على 0.9% أجار ويعنى ذلك أن حركة الأوعية المحتوية على البيئة ستؤدى إلى غمر الأجزاء النباتية مما يقلل التهوية ويزيد من مشكلة التميؤ الزجاجي. وبالرغم من ذلك كانت هناك استجابة موجبة في نمو هذه الأجزاء مما يعنى توفر التهوية بطريقة غير معروفة. أما زيادة التركيز عن 3% فقد أدت إلى تكوين وسط شديد التماسك يصعب معه صب البيئة.

جدول 7: مقارنة الآجار بصمغ الكاترا كمصلب للبيئة المستعملة لزراعة أنسجة نباتات Syzgium cuminii و Albizzia lebeck كما أوضحها Jain & Barbbar (2002)

جدول 8: تأثير خلط الآجار (A) وصمغ الكاترا (G) على لزوجة البيئة واستجابة الأنسجة المنزرعة لنبات Syzgium cuminii كما أوضحها Jain & Barbbar (2002).

جدول 9 : تأثير خلط الآجار (A) وصمغ الكاترا (G) على لزوجة البيئة وتكوين الأجنة الجسدية في نبات Albizzia lebeck كما أوضحها (2002) Jain & Barbbar.

وعند خفض تركيز الصمغ إلى أقل من 3% مع إضافة الآجار بتركيز 0.2- 0.6 % لم تستجب الأجزاء المنزرعة وخاصة Albizzia lebeck حيث لم تتكون أي أجنة جسدية ويرجع ذلك إلى عدم صلابة البيئة بدرجة كافية لتدعيم الأجزاء المنزرعة وتوفير التهوية لها، ولم يختلف تركيز 3 % من الصمغ عن 0.9 % آجار. بالإضافة إلى ذلك لم تلاحظ زيادة في سيولة البيئة خلال مدة التجربة والتي استمرت شهرين مما يؤكد عدم حدوث تحلل للصمغ.

7. الفيرمكيوليت Vermiculite

ليس من الشائع حتى الآن استخدام الفيرمكيوليت وهو عبارة عن سيليكات مائية كبديل للآجار حيث تتحرر بعض الإيونات كالبوتاسيوم عند تعقيمه. لكن قام (2008) Al Qahtani & Alkhateeb بدراسة نمو الأجنة الجسدية لأحد أصناف النخيل باستعمال بيئة تحتوي على الأجار والفيرمكيوليت والبيتموس والبيرليت. وقد أشار إلى إمكانية نمو تلك الأجنة في البيئات المختلفة إلا أن أفضل نمو كان عند استخدام الفيرمكيوليت ثم الأجار ، أما إنبات الأجنة فكان أفضل في بيئة الفيرمكيوليت. وكان الإنبات ضعيف جدا عند استعمال البيرليت أو البيتموس.

قام (2000) Afreen-Zobayed et al. باستعمال خليط مكون من نسب مختلفة من الفيرمكيوليت ومخلفات مصانع الورق من paper pulp لتنمية نبيتات البطاطا Ipomoea batatas الناتجة من الإكثار الدقيق في المعمل ومقارنة ذلك بالبيئة المستعمل فيها الآجار. وأشارت الدراسة إلى أن استعمال خليط مكون من 70% من الفيرمكيوليت مع لب الورق كان أفضل من استعمال الأجار أو أي من النسب الأخرى من خليط الفيرمكيوليت مع لب الورق، حيث يتضح من جدول رقم (10) أن الوزن الطازج للأفرع والجذور كان أعلى بمعدل 2.7 % بالمقارنة من النبيتات النامية في بيئة مصلبة بالآجار.

كما كانت قياسات النمو للأجزاء الخضرية متمثلة في ارتفاع الساق وعدد الأوراق أفضل بوجه عام. أضف إلى ذلك أن معدل البناء الضوئي لتلك النباتات كان أعلى من نباتات المقارنة، فبعد ثلاثة أسابيع من الزراعة كان معدل استهلاك ثاني أكسيد الكربون 15.3 مليمول/ ساعة مقابل 9.8 فقط للنباتات النامية في بيئة الآجار. يشير ذلك إلى أن النباتات أصبحت ذاتية التغذية بدرجة أكبر، وبالتالي يتوقع سهولة أقلمتها. وتجدر الإشارة إلى أن النباتات النامية في بيئة من الفيرمكيوليت فقط كانت غير جيد النمو بالمقارنة مع الخليط المكون من 70% فيرمكيوليت و 30% لب الورق. لكن لم يكن هناك فرق معنوي في قابلية النباتات للأقلمة حيث تراوحت النسبة بين 90 - 100% للنباتات الناتجة من بيئة محتوية على أي نسبة من الفيرمكيوليت ولب الورق. أما النباتات الناتجة من بيئة متصلبة بالآجار فكانت نسبة نجاح أقلمتها 73% فقط. وامتد تأثير بيئة النمو إلى النباتات بعد الأقلمة حيث كانت النباتات التي نمت في بيئة محتوية على الفيرمكيوليت ولب الورق أول سوقا وذات عدد أكبر من الأوراق وتجب الإشارة إلى تحرر بعض البوتاسيوم من الفيرماكيوليت اثناء التعقيم الحراري.

جدول 10: مقارنة تأثير الأجار وخليط الفيرمكيوليت مع لب الورق على نمو نبيتات البطاطا Ipomea potatas في مزارع (2000 ,.et al الأنسجة Afreen-Zobayed)

8. الكاراجينين والجيلاتين K-carrageena and Gelatin

يحتاج carrageenan- K إلى وجود بعض الكاتيونات لتصلبه كما هو الحال في Gelrite ويستعمل بتركيز 0.6% ليعطى صلابة تعادل 0.2% من Gelrite أو 0.8 % أجار. حاول البعض استخدام الجيلاتين بتركيز 10 % لكنه لا يستخدم كثيرا حيث ينصهر عند درجة حرارة 30 - 35°م كما يعتبر وسط مثالي لنمو الميكروبات. وهناك العديد من المركبات التي تم استخدامها كبدائل أخرى للآجار كالصوف الزجاجي أو الصخري، كرات صغيرة من الزجاج، ورق الترشيح فوق البيئة السائلة، استعمال قطع من الإسفنج تحت ورقة الترشيح كما يمكن تحميل المُستأصل النباتي على مادة ذات ثقوب ومنها بعض الأغشية المصنعة من البولي بروبلين مثل 3500 Celgard .Questar Corp., Charlotte, N.C واعطت نمو جيد بالمقارنة مع البيئات السائلة الثابتة أو الآجار ويميز هذه المواد إمكانية استعمالها أكثر من مرة كما يمكن تغيير البيئة وإعادة تقسيم المزرعة دون الحاجة إلى تغيير الوعاء المستعمل أثناء الزراعة، سهوله نقل النباتات للتربة، استعمال قدر قليل من البيئة (2008 ,.Thorpe et al).