قص وقطع الحمض النووي Cleavage of DNA

كما هو معروف فان البروتينات توجد داخل الخلية على شكل قطع منفصلة عن بعضها البعض وهذا بالطبع يسهل عملية فصلها بطرق تقنية مناسبة . ولكن الجينات الموجودة على الكروموسومات على شكل حبات متصلة ببعضها البعض وليست على شكل قطع منفصلة . وهذا التسلسل والترابط في الجينات جعل عملية فصل وعزل واستخلاص جين محدد عن بقية الجينات مهمة صعبة ان لم تكن مستحيلة حتى قبل عام 1970 م ، ولكن اكتشاف الانزيمات القاطعة Restriction Nucleases ساعد في عملية استخلاص الجينات وقطع DNA ونسخها .

- الانزيمات القاطعة Restriction Nucleases

لا شك ان لكل كائن حي  وسائل دفاعية مختلفة تحمية من غارات الاعداء وهجوم المعتدين ، فالبكتيريا هي احدى هذه الكائنات والتي لها اعداء كثيرة ومن اهم اعدائها الفيروسات المختلفة . ولقد قامت بعض البكتيريا بإنتاج انزيمات مهمتها تدمير الفيروسات . وتقوم هذا المقصات او ادوات القطع يقص الحمض النووي للفيروس وبذلك يشل عمله ويبطل مفعولة .

شكل (1) : الانزيمات القاطعة

وبما ان DNA مادة موجودة بشكل طبيعي في البكتيريا كما هو الحال في الفيروسات والكثير من الكائنات الحية فان هذه المقصات قد تشكل خطرا على البكتريا نفسها عند قصها DNA الخاص بها (الشكل 1-2) .

شكل (2): مثالا للأنزيمات القاطعة

ولكن هذا لا يحدث والسر في ذلك هو قيام البكتيريا بتحوير اجزاء من الدنا الخاص بها عن طريق إضافة مجموعة الميثيل Methyl الى بعض الاحماض النووية من نوع الادنين او السيتوسين ومن     ثم لا يستطيع القاطع من قص الحمض النووي الخاص بالبكتيريا . وعند اكتشاف هذه القواطع في السبعينات من القرن العشرين بدء العلماء في استخدامها كمقصات لقص الدنا . وساعدتهم هذه المقصات في عملية التحكم في المادة الوراثية . ويوجد حاليا اكثر من مائه نوع من هذه المقصات (شكل 2) . وتقسم هذه المقصات  الى نوعين رئيسيين ، النوع الاول يقص شريط الدنا لمزدوج بشكل راسي مستقيم Blunt ends والنوع الثاني يقص بشكل متعرج Staggered cuts وبالتالي يجعل طرفي الدنا المقطوع مادة قابلة للصق قطعة غريبة من الدنا فيها . وعند لصق قطعة من الدنا في داخل الفراغ الناتج من القطع ينتج لنا قطعة مركبة من قطعتين مختلفتين من الدنا وهذه القطعة تسمى دنا معاد التوليف (هجين) او Recombinant DNA .

والسؤال هنا هو كيف يتعرف الانزيم القاطع على المكان المفترض ان يحدث فيه القطع ؟

  كل انزيم قاطع     يعبر عن مقص خاص لقطع الدنا في نقطه محددة . ويتعرف الانزيم القاطع على مكان القطع حسب تسلسل الدنا للقطعة . فكل انزيم قاطع يقطع في تسلسل محدد . فمثلا الانزيم القاطع المعروف بالهيبا واحد Hpa 1 يقطع عندما يجد 6 من الاحماض الامينية في هذا التسلسل GTTAAC بينما الانزيم القاطع ايكو ار واحد Eco R1 يقطع    عندما يجد 6 من الاحماض الامينية في هذا التسلسل GAATTC . وللمعلومة فان الهيبا واحد سمي بهذا الاسم لأنه يوجد في بكتيريا الهيموفلس بارا انفلونزا Hemophilus parainfluenza وهذا الانزيم يعتبر من الانزيمات التي تقطع بشكل راسي مستقيم ، بينما الانزيم الايكو ار واحد فهو مأخوذ من بكتيريا E.coli ويعتبر من الانزيمات التي تقطع بشكل متعرج .

ويوضح الجدول (1) تسلسل مواقع القطع   Recognition sites لبعض الانزيمات القاطعة كالاتي :

       - القطع المحددة Restriction Fragments

       عندما يضاف الانزيم القاطع الى محلول به شريط من الدنا فانه يقطعه الى عدة قطع وليس الى قطعتين فقط . وكل قطعة مقطوعة بالأنزيم تسمى قطعة محددة. ويختلف طول هذه القطع حسب المسافة التي بين كل مقطع واخر . ولكن يجب ان تكون كل قطعة محددة لها نفس الحجم في كل نوع من الكائنات الحية وذلك يعني ان للإنسان قطعة محددة معينه يقطعها الانزيم القاطع في الكروموسوم ، ويمكن التأكد من ذلك بتحليل قياس لهذه القطعة بتقنية حركة DNA الكهربائية على الجل (شكل 3) .

واذا افترض ان انسان ليس لديه نفس الحجم المفترض لقطعة ما من الدنا ففي هذه الحالة نستنتج ان بهذا الشخص طفرة (تغير في تسلسل الدنا ) في احدى اماكن التي كان من المفترض يكون قد اختلف وتعرف هذه الظاهرة عند العلماء الوراثة بتفاوت القطع المحددة المصحوب بطفرة Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ولقد انشا العلماء خريطة تسمه خريطة القطع المحددة لكثير من الكائنات الحية كما ذكر من قبل او تبين هذه الخريطة مكان القطع ومحلها مقارنة بالقطع الاخرى ، وتم عمل هذه الخريطة عن طريق تقطيع جميع الكروموسومات بإضافة انواع مختلفة من الانزيمات القاطعة  ثم رتبت هذه القطع بشكل منتظم .

شكل (3) : قطع الدنا بأنزيمات القطع على لوح جل الاجاروز

  وكان الهدف من هذه الخريطة هو تحديد نقاط  وعلامات على طول الشريط الطويل من الدنا التي تتركب منه الكروموسومات وعند المقارنة بين هذه القطع في الكائنات المختلفة. ولقد وضعت هذه النقاط على لوح من الاجاروز وفصله واخرج حجمها كما هو موضح في الشريط الاسود ، ويمكن وضع هذه النقاط على لوح الجيل وفصلها الى وحدات اصغر .                                                                                                         

- قطع DNA على لوح من الجل بالترحيل الكهربائي Gel Electrophoresis

استعمل العلماء تقنية فصل البروتينات عن بعضها البعض عن طريق تحركها على الجل (هجرة كهربائية ) وانفصالها عن بعضها البعض حسب الوزن الجزيئي لها في صورة حزم bands or fragments وكذلك حسب الشحنة الكهربائية الموجودة على الحزم ، وذلك عن طريق تعريضها الى تياركهربائي وهي على لوح من المادة الهلامية المعروفة بالجل . ولقد استعمل العلماء نفس الفكرة في فصل قطع الدنا  عن بعضها البعض (شكل 4) .

شكل (4) : قطع DNA على لوح من الجل بالكهرباء

ومن المعروف ان للحمض النووي شحنة سالبة ولذلك فعند وضع بعض من الدنا في طرف من اطراف قالب الجل ثم تعرض لسريان تيار كهربائي بحيث يكون القطب السالب عند الطرف الذي وضعنا فيه الدنا والقطب الموجب عن الطرف الاخير من القالب فان الدنا ينتقل تلقائيا باتجاه الطرف الموجب . وتتوقف حركة قطع او   حزم الدنا على حسب  احجامها على طول اللوح . فالقطع او الحزم الصغيرة تتحرك بشكل اكبر من القطع الكبيرة . وبذلك يمكن فصل هذه القطع عن بعضها البعض. ويمكن تحديد الحجم الفعلي لكل قطعة او حزمة عن طريق اضافة قطع معروفة الحجم من الدنا التي اتكون بمثابة مقياس يرجع اليه لاستنتاج حجم القطع . وعلى اية حال هناك نوعان اساسيان من الواح الجل ، الاول يسمى بجل الاجاروز Agarose gel والثاني يسمى بجل البولي اكريلاميد Polyacrylamide gel .

ونظرا لصغر الفراغات التي بين جزيئات الاجاروز فانه يستخدم لفصل القطع الصغيرة الحجم من الدنا وفي العادة التي تكون اصغر من 500 جزئ من الحمض النووي والتي تتفاوت بين بعضها البعض بجزئ او جزيئين . بينما يستخدم البولي اكريلاميد للأحجام الاكبر من الدنا والتي يتراوح حجمها بين 300-10000 جزئ من الدنا . ومادة الاجاروز هي مادة كربوهيدراتية مستخرجة من الطحالب وعند تحضيرها فانها تشبه في قوامها الجل الذي نأكله ولكنها اقوى بعض الشيء ولكنها قابلة للتهتك او الانقطاع عند التعامل معها بلا حذر .

ولقد واجهه العلماء صعوبات في فصل القطع الكبيرة من الدنا وذلك لان هذه الشظايا وعند وضعها على جل الاكاروز وبعد توصيل التيار الكهربائي اليها تتوقف لأنها تتمدد بشكل متعرج على شكل ثعبان ملتوي باتجاه القطب السالب والاخر باتجاه القطب الموجب . ولقد حلت هذه المشكلة عن طريق تعريض جل الاكاروز الى مستويات متفاوتة من القوة الكهربائية على طول اللوح وبذلك فان قطعة الدنا الطويلة عندما تتعرض الى التيار كهربائي مختلف يجعلها تعدل من تمددها المتعرج قبل ان تدخل في التيار الكهربائي الجديد ويستمر هذا التفاوت في التيار والتعديل في قوام القطعة حتى يصل الى المكان الذي يجب ان تقف فيه حسب حجمها . ويسمى هذا النوع من الفصل بالفصل عن طريق المجال الكهربائي المتردد Pulsed-field .

ولقد مكنت هذه التقنية من فصل قطع كبيرة من الدنا وحتى فصل قطع من الكروموسومات على الجل وتتراوح القطع التي يمكن فصلها بهذه الطريقة بين 220000 الى 25 مليون جزئ من الدنا . وتجدر الاشارة ان القطع المفصولة بالبولي اكريلاميد والاكاروز لا تكون واضحة للعيان ولذلك يجب تعرض لوح الجل للضبغ بمادة بروميد الاثيديوم Ethidium bromide والتي تلمع عند تعرضها للأشعة فوق البنفسجية . وهناك طريقه اكثر دقه لمشاهدة القطع على لوح الجل وهذه الطريقة تعتمد على اضافة مادة مشعة نووية الى الدنا قبل ان يوضح على لوح الجل ولكن هذه الطريقة تحتاج الى احتياطات معينة لكي لا تضر من يستخدمها .

المصادر:

عبيده ، علي ابراهيم علي و محمود ، احمد عبد الفتاح .اساسيات التقنية الحيوية . كلية الزراعة جامعة الاسكندرية .