1- المبدأ الاساسي Basic Principle

تم استخدام طريقة انزيمية (Richmond, 1973) لتقدير كمية الكوليسترول باستخدام محاليل جاهزة من شركة (Bio Merieux) الفرنسية والمحتوية على الكوليسترول استريز الذين يعمل على تحويل الكوليسترول المؤستر في مصل الدم إلى كوليسترول واحماض دهنية ، بوجود الاوكسجين وانزيم الكوليسترول اوكسديز اللذان يعملان على اكسدة الكوليسترول الحر والمتكون من التفاعل الاول إلى الكوليست – 4 – اين – 3 – ون (Cholest-4-en-3-one) وبيروكسيد الهيدروجين . اذ ان بيروكسيد الهيدروجين المتكون يتفاعل مع الفينول و 4 – أمينو أنتي بايرين بوجود انزيم البيروكسيديز ليتكون لون وردي ناتج من مركب كينون إيمين (Quinoneimine) ، تقاس شدة اللون بجهاز المطياف الضوئي عند طول موجي (500) نانوميتر مقابل محلول الكفء (Blank Solution) الذي يحتوي جميع الكواشف ما عدا الكوليسترول .

(Pesec & Bodourian , 1977 ; Williams & Heinemann , 1978; Burtis & . Ashwood , 1999.)

(2) المحاليل المستخدمة Reagents Used

1. المحلول المنظم Buffer Solution

يتكون من محلول الفوسفات المنظم (0.1) مول / لتر ، (15) ملي مول / لتر فينول ، (3.74) ملي مول / لتر كولات الصوديوم الصابونية (Sodium Cholate Surfactant).

2. المحلول الانزيمي Enzyme Solution

يتكون من (0.5) ملي مول / لتر 4-أمينو أنتي بايرين ، (³  1000) وحدة / لتر أنزيم البروكسيديز ، (³  200) وحدة / لتر أنزيم الكوليسترول أوكسيديز و (³  125) وحدة / لتر من أنزيم الكوليسترول أستريز.

3. المحلول القياسي Standard Solution

يتكون من (200) ملغرام كوليسترول / 100 مليليتر ايثانول لا مائي (Ethanol Absolute). 

حضر الكاشف المستخدم من اضافة المحلول الانزيمي على المحلول المنظم ورجهما بشكل جيد والذي يكون مستقرا لمدة ثلاثة اسابيع بدرجة (20-25) ْم أو لمدة ثلاثة أشهر بدرجة (2-3) ْم .

(3) طريقة العمل Procedure

1. محلول الاختبار Test Solution

 وضع (1) مليليتر من المحلول الكاشف المستخدم في انبوبة اختبار ، واضيف اليها (10) مايكروليتر من مصل الدم مع المزج بشكل جيد .

2. المحلول القياسي Standard Solution

وضع (1) مليليتر من المحلول الكاشف في انبوبة اختبار ثانية ، وأضيف اليها (10) مايكروليتر من المحلول القياسي مع الرج .

3. المحلول الكفء Blank Solution

وضع (1) مليليتر من المحلول الكاشف في انبوبة اختبار ثالثة ، ووضعت الانابيب الثلاثة في حمام مائي بدرجة (37) درجة مئوية لمدة خمس دقائق لاتمام التفاعل ، ثم قيست شدة اللون عند طول موجي قدره (500) نانوميتر مقابل محلول الكفء
(Blank Solution)، اذ يبقى اللون ثابت لمدة (30) دقيقة .

(4) الحسابات Calculation

تم حساب تركيز الكوليسترول في العينة وفق القانون الاتي :-

تركيز الكوليسترول = ملي مول / لتر