زراعة الأنسجة النباتية وتقاناتها المختلفة

1- مقدمة Introduction

يسعى الإنسان دائماً إلى اكتشاف أسرار الطبيعة عن طريق البحث العلمي، واكتشاف الطرائق والتقانات الحديثة التي تفيد في مواكبة التطور والتحديث في مختلف مجالات الحياة، تعد تقانات زراعة الأنسجة النباتية مجموعة مهمة من التقانات الحديثة التي لعبت دوراً ولاتزال لها أهمية كبيرة في تطوير الإنتاج الزراعي وتحسينه في مجال العلوم النباتية بشكل عام وعلوم البستنة بشكل خاص.

تعود فكرة زراعة الأنسجة إلى العالم الألماني Hamberland عام (1902) عندما زرع بعض خلايا البشرة في وسط كنوب وبقيت على قيد الحياة عدة أشهر دون أن تبدي أية استجابة للانقسام والنمو، وفي عام 1922 تمكن العالمان Kott et Roblins من الحصول على استطالة قمم جذرية في البندورة من عدة ميليمترات إلى 4-5 سم وبقيت في الوسط المغذي عدة أشهر ثم ماتت.

يعد العالم الأمريكي White عام (1932) أول من حصل على انقسام خلايا قمم من جذور البندورة بشكل غير محدود، كما تمكن العالم الفرنسي Gautheret عام (1934) من الحصول على نتائج مماثلة بدءاً من زرع خلايا كامبيوم لبعض الأشجار الحراجية.

يعد العالمان White و Gautheret أول من وضع أسس تقانات زراعة الأنسجة النباتية. وتتالت الأبحاث والاكتشافات مع مرور الزمن. وقد استعملت المستخلصات النباتية والعصائر مثل سائل جوز الهند في زراعة الأنسجة لتنشيط النمو قبل اكتشاف الهرمونات النباتية. وقد استخدمت الهرمونات النباتية لأول مرة من قبل العالمين Skoog and Miller عام 1957، فقد أوضحا الدور الإيجابي لكل من الأوكسين والسيتوكينين في نمو أجزاء نباتية من التبغ المزروع في وسط مغذ بشكل معقم داخل الأنابيب.

وقد تمكن العالمان Morel and Martin عام 1958 من الحصول لأول مرة على نباتات سليمة من الفيروسات عن طريق زراعة الميرستيم المأخوذ من نبات بطاطا مصاب بالفيروسات وقد تمكنوا من وضع تقانة زرع الميرستيم لأول مرة.

استطاع الباحث Hildebrand عام 1965 من الحصول على نباتات كاملة بدءاً من زرع خلايا جنينية من التبغ في وسط مغذ سائل، وفي عام 1969 حصل العالمان Nitch and Nitch على نباتات وحيدة الصيغة الصبغية بدءاً من زرع حبوب لقاح لنبات التبغ. وقد قام العالم Garlson وزملاؤه عام 1972 من وضع تقانة لعزل البروتوبلاست وحصلوا على نباتات كاملة بدءاً من دمج نوعين من البروتوبلاست من التبغ.

لقد تطورت تقانات زراعة الأنسجة النباتية خلال العقدين الأخيرين تطوراً كبيراً وشملت عدداً كبيراً من النباتات وتوسعت فوائدها التطبيقية في الإكثار والتحسين النباتي، واستنباط أصناف جديدة، وإكثارها خضرياً. ففي عام 1990 تم إنتاج أكثر من 60 مليون نبات على مستوى فرنسا فقط باستخدام تقانات زراعة الأنسجة النباتية المختلفة (1991 ,Coudret).

وأما حالة اختيار الجزء النباتي، والذي له علاقة مباشرة بزراعة النسج، وعمر النبات الأم فكلما كان النبات الأم فتي Juvenile كانت قدرته كبيرة على النمو والإكثار بالنسج وتنخفض القدرة على التشكل والنمو تنخفض مع تقدم النبات بالعمر حتى تصل إلى مرحلة التوقف في النباتات الهرمة، وهذا الأمر يلاحظ بشكل كبير في الأشجار الخشبية والحراجية.

إذا أردنا إكثار شجرة معمرة لتميزها في بعض الصفات الجيدة، لا بد من إجراء عملية إعادة فتوة أو ما يسمى تجديد فتوة Rejuvenation حتى تستعيد قدرتها على الإكثار والتجذير بالنسج.

تعد تقانات زرع الأنسجة النباتية إحدى الطرائق المهمة في تجديد فتوة الأشجار المعمرة، حيث تكتسب الأجزاء النباتية المزروعة بالأنابيب صفات النباتات الفتية مع زيادة عدد مرات النقل على الوسط المغذي والأمثلة كثيرة على ذلك. في البطاطا العنب، الجربيرا وفي النخيل (Auge et al., 1984; AlMaarri, 1995).

2- مفهوم زراعة الأنسجة النباتية:

يقصد بزراعة النسج، زراعة أجزاء نباتية صغيرة تتراوح أبعادها بعدة ميكرونات حتى 1 - 2 سم (عقل صغيرة، براعم، قمم نامية، قمم مرستيمية، حبوب لقاح، خلايا مفردة وبروتوبلاست) في أوساط مغذية محددة التركيب بحيث تحوي كافة المتطلبات الغذائية اللازمة لنمو الأجزاء المزروعة، ثم توضع الأنابيب المزروعة في شروط جوية خاصة داخل غرف النمو لتحريضها على النمو والإكثار. يشترط أن تتم كافة عمليات الزرع في جو معقم وباستخدام أدوات ومحاليل وأجزاء نباتية معقمة.

إن المفهوم التقليدي للإكثار الخضري هو استخدام أجزاء نباتية في الإكثار بهدف الحصول على نباتات مشابهة تماماً في الصفات المورفولوجية والوراثية والانتاجية لصفات النبات الأم التي أخذت منه الأجزاء النباتية.

أما المفهوم الحديث للإكثار الخضري عبر استخدام تقانات زراعة النسج، فليس من الضروري الحصول على نباتات مشابهة في تركيبها الوراثي للنبات الأم، فقد نحصل على نباتات مشابهة أو مغايرة في التركيب الوراثي للنبات الأم، ويعود ذلك حسب الأجزاء النباتية المستخدمة، وحسب الهدف من زراعة النسج وحسب الأوساط الغذائية المستخدمة. ففي تقانات التكاثر الخضري الدقيق Micropropagation يتم الحصول على نباتات مشابهة تماما بالتركيب الوراثي للنبات الأم. وفي زرع الكالوس Callus Culture أو حبوب اللقاح يمكن أن نحصل على نباتات مشابهة أو مغايرة في التركيب الوراثي للنبات الأم ولهذا السبب لهذه التقانات أهمية في تربية والتحسين الوراثي للنبات.

3- طرائق زراعة الأنسجة النباتية:

تقسم تقانات زراعة الأنسجة النباتية إلى مجموعتين من الطرائق:

3-1- طرائق الإكثار: تشمل كافة الطرائق التي يتم فيها استخدام أجزاء نباتية حاوية على أنسجة مرستيمية أو زراعة أنسجة نباتية تعطي أنسجة مرستيمية مباشرة دون المرور بمرحلة الكالوس وتشمل الطرائق الآتية:

أ- التكاثر الخضري الدقيق Micropropagation: وتضم التقانات الآتية:

- زراعة العقل الصغيرة Microcuttings بطول 1-2 سم وتحوي برعماً جانبياً أو طرفياً.

- زراعة براعم وقمم نامية بحجم 1-5مم ولها عدة مسميات مثل: Shoot apex Apex culture, culture او Bud culture.

- زراعة الميرستيم Meristem Culture. وهو بحجم من 0.1-1 مم.

- زراعة البراعم والأقراص الزهرية Bud flower culture ويتم زرع البراعم الزهرية، أو الأقراص الزهرية بأحجام مختلفة تختلف باختلاف الأنواع النباتية.

ب- التطعيم المخبري الدقيق In Vitro Micrografting: ويتم فيه تطعيم قمم مرستيمية من نباتات موثوقة على بادرات بذرية بهدف الحصول على نباتات خالية من الأمراض الفيروسية أو لأهداف أخرى مثل دراسة التوافق بين الأصل والطعم.

ج- تكوين الدرينات الدقيقة In vitro Microtuberization : وهي طريقة مهمة تستخدم في إكثار بذار البطاطا بهدف الحصول على بذار خال من الأمراض الفيروسية، وهذه التقانة تستخدم في النطاق التجاري في كثير من دول العالم، ويتم تكوين الدرينات الصغيرة داخل الأنابيب، ويتم زرع القمم المرستيمية في البداية وبعد التأكد من خلو النموات الناتجة من زراعة الميرستيم من الفيروسات يتم بعدها إنتاج الدرينات لتكون أمهات في انتاج البذار.

د- تكوين المباشر للبراعم Direct Organogenesis: وتتم زراعة أجزاء نباتية خالية من الأنسجة المرستيمية مثل زرع الأوراق أو أعناق أو سلاميات. ويتم تكوين براعم مباشرة وتتطور البراعم وتتكاثر لإعطاء نباتات كاملة.

هـ- الإكثار بالأجنة الخضرية Embryogenesis ويتم زرع أجزاء نباتية قد تحوي أو خالية من الأنسجة المرستيمية توجه الأجزاء المزروعة نحو تكوين الكالوس الجنيني أو تكوين الأجنة الخضرية مباشرة.

3-2- طرائق التحسين الوراثي:

ويتم فيها زرع أجزاء نباتية خالية من الأنسجة المرستيمية كما تمر بمرحلة الكالوس عند تطورها، ومن هذه الطرائق:

1- زراعة الخلايا النباتية Plant Cell Culture: تزرع الخلايا النباتية ضمن معلق خلوي في أوساط مغذية سائلة ومتحركة، ولهذه التقانة تطبيقات مهمة في إنتاج المركبات الثانوية، والمواد الفعالة المستخدمة في صناعة الأدوية، والصناعات التجميلية والتحويلية، ولها أيضاً تطبيقات في تربية النبات والتحسين الوراثي.

2- زراعة البروتوبلاست Protoplast: Culture: البروتوبلاست هي خلية نباتية خالية من الغشاء البكتوسللوزي، ولها تطبيقات مهمة في مجال تربية النبات والحصول على هجن خضرية متجانسة، وتعد إحدى طرائق الهندسة الوراثية.

3- زراعة المآبر وحبوب اللقاح Anther and Grain Pollen Culture: تزرع حبوب اللقاح بهدف الحصول على نباتات وحيدة الصيغة الصبغية التي لها أهمية كبيرة في تربية النبات للمحاصيل المختلفة.

4- زراعة الكالوس Callus Culture: يتم الحصول على الكالوس من أجزاء نباتية مختلفة تحت تحريض هرموني وخاصة الـ  D4-2 ، ويتم إكثار الكالوس والعمل على تطوره للحصول على نباتات كاملة وتسمى عملية تطور الكالوس لتكوين نبات كامل بالـ Regeneration System. تعد عملية إكثار الكالوس بهدف زيادة الخلط الوراثي للحصول على تراكيب وراثية جديدة قد تكون مهمة في برنامج تربية النبات وهذا ما يدعى بالـ Somaclone Variation.

4- تطبيق تقانات زراعة الأنسجة النباتية:

تحتاج تطبيق تقانات زراعة الأنسجة النباتية إلى دقة وخبرة عالية وتوفر المخابر المجهزة والضرورية لتنفيذ العمل بنجاح، ويعزى السبب إلى وجود عوامل كثيرة تؤثر في نجاح تطبيق زراعة الأنسجة مثل عوامل الأوساط المغذية، عوامل البيئة وشروط غرف النمو، عوامل مرتبطة بالأنواع النباتية، عوامل مرتبطة بالقائم على المشروع والخبرة ضرورية لنجاح المشروع عوامل مرتبطة بالنظافة وعقامة المخبر، إذ يعد التلوث العدو الأول لتقانات زراعة الأنسجة النباتية لهذا السبب يجب أن تكون عوامل الأمان والنظافة في مخبر زراعة الأنسجة النباتية مثل غرفة العمليات الخاصة بالمشافي.

تعد تقانات زراعة الأنسجة النباتية من الطرق الحديثة في الإكثار الخضري إذ تسمح بإنتاج أعداد كبيرة من النباتات المشابهة للنبات الأم والخالية من الأمراض وذات مواصفات عالية الجودة، كما تستخدم في مجال التحسين الوراثي إن الخطوط العريضة لكافة تقانات زراعة الأنسجة النباتية متشابهة. تختلف من حيث الهدف والغرض ونوعية الطريقة المستخدمة، ونوعية الجزء النباتي المستخدم وفي تركيب الأوساط المغذية اللازمة وفي شروط ومراحل الزرع.

وهنا سوف نلقي الضوء على الخطوات الأساسية العامة المشتركة بين جميع تقانات زرع الأنسجة، وسوف تتم معالجة خصوصيات كل طريقة عند دراستها فيما بعد بشكل منفصل. تشمل الخطوط العريضة لتطبيق تقانات زراعة الأنسجة الخطوات الآتية:

1 - تحضير الأوساط المغذية وتعقيمها

2 - تحضير الأجزاء النباتية وتعقيمها

3- عزل الأجزاء النباتية وزراعتها

4- وضع العينات المزروعة في غرف النمو لحثها على النمو.

4-1- تحضير الأوساط المغذية وتعقيمها: تؤثر الأوساط المغذية بشكل مباشر في نجاح زراعة الأنسجة النباتية، وتحتوي الأوساط المغذية على كافة العناصر الضرورية اللازمة لنمو وتطور العينات المزروعة، يختلف تركيب البيئات الغذائية بحسب النوع النباتي، والجزء المزروع، وحسب الهدف من زرع الأنسجة النباتية وحسب مرحلة الزراعة. يزداد تركيب الوسط المغذي تعقيداً كلما صغر حجم الجزء النبات المزروع، ويتألف الوسط المغذي بشكل عام من العناصر المعدنية الكبرى والصغرى، ومصدر للطاقة، وفيتامينات، وأحماض أمينية، وهرمونات نباتية وبعض المركبات العضوية أو المعدنية الأخرى التي تضاف إلى الوسط المغذي لأغراض محددة.

تعبأ الأوساط المغذية بأنابيب اختبار من نوع البيركس القابل للتعقيم وتغلق بسدادات معدنية أو بلاستيكية، وتعقم في الأوتوغلاف تحت ضغط على درجة حرارة 115م لمدة 30 دقيقة أو على درجة حرارة 121م لمدة 15-20 دقيقة.

4-2- تحضير الأجزاء النباتية وتعقيمها: تختلف طريقة تحضير العينات النباتية لزراعة النسج بحسب النوع النباتي، وحسب الهدف من زرع الأنسجة النباتية وحسب طبيعة وحجم الجزء النباتي المزروع.

تؤخذ العينات النباتية من أمهات مطابقة للنوع والصنف المراد زراعته جيدة النمو وخالية من الأمراض، يفضل أن تكون الأمهات نامية في بيت محمي وخاضعة لبرنامج رش وقائي لأن النباتات النامية بالحقل أو بالطبيعة تحوي تلوثاً أكبر بكثير من النباتات المرباة بالبيوت المحمية، وتكون حمولة الأجزاء الهوائية من الأحياء الدقيقة أقل بكثير من حمولة الأجزاء النباتية الأرضية، وتعد عملية الحصول على عينات خالية من التلوث شرطاً أساسياً لنجاح زراعة النسج.

تستخدم المواد الكيميائية والمطهرات في تعقيم العينات النباتية توجد عدة مواد تستخدم بشكل واسع في التعقيم السطحي للعينات النباتية مثل:

- هيبوكلوريت الصوديوم (NaOcl) ، هيبوكلوريت الكالسيوم ( ₂Ca(Ocl) )، الماء الأوكسيجيني، كلوريد الزئبق، نترات الفضة، برمنغنات البوتاسيوم، الكحول وبعض المركبات الجاهزة مثل الـ Domestos والكلوروكس (Jones et al., 1977 Marri et al., 1986)

تختلف تراكيز المادة الفعالة ونوع المادة الفعالة والفترة الزمنية باختلاف الأنواع النباتية، وطبيعة العينات النباتية المستخدمة.

تقسم الأجزاء النباتية من حيث تحملها للتعقيم إلى:

- عينات قاسية تتحمل تراكيز عالية، لفترة زمنية طويلة مثل الأجزاء المتخشبة والبذور القاسية.

- اجزاء نصف غضة مثل النموات نصف غضة والبراعم الجانبية والنموات الغضة الطرفية والجذور الرفيعة وبعض البذور الغضة.

- أجزاء غضة ورهيفة مثل الأوراق والوريقات المرستيمية وأعناق الأوراق.

وتجدر الإشارة أخيراً يجب وضع تقانة للتطهير السطحي تناسب كل نوع نباتي يراد زرعه داخل الأنابيب. ويجب أن تتم عملية التعقيم تحت شروط معقمة وباستخدام أدوات معقمة.

4-3- زراعة الأجزاء النباتية: تختلف طريقة فصل الأجزاء النباتية وزراعتها في الأوساط المغذية المحضرة سابقاً، حسب الجزء النباتي المزروع، حسب تقانة الأنسجة المستخدمة وحسب الهدف من زراعة النسج.

يتم عزل العينات النباتية وزرعها في غرف خاصة تدعى غرف العزل ويجب أن تكون هذه الغرف معقمة نظيفة معزولة، وغير معرضة للتيارات الهوائية المباشرة، وخالية من النوافذ وغير قريبة من الممرات العامة في المخبر، كما توضع في غرف العزل أجهزة خاصة تؤمن العمل في جو معقم وتسمى أجهزة العزل الجرثومي Laminar air flux hood.

4- وضع الأنابيب المزروعة في غرف النمو: توضع الأنابيب المزروعة في غرف خاصة تسمى بغرف النمو growth room إذ يتم التحكم بالحرارة والإضاءة والرطوبة، يجب أن تكون غرف النمو نظيفة ومعزولة عن الجو الخارجي. وتزود بأجهزة تحكم بالحرارة والإضاءة والرطوبة بحيث تؤمن الظروف الجوية المناسبة للنمو النباتي.

5- إنشاء مخبر لزراعة الأنسجة النباتية:

تتطلب زراعة النسج أماكن خاصة، نظيفة ومحمية من عوامل الوسط الخارجي، لأن عمليات الزرع في سائر مراحلها تتم ضمن ظروف معقمة، ويجب أن تتوفر في المخبر الخاص بزراعة النسج جميع الأجهزة والمواد والأدوات الضرورية لتطبيق زراعة الأنسجة النباتية بكافة طرائقها، كما يتطلب إكثار النباتات بالأنسجة توافر شروط مناسبة لعملية التقسية حتى نستطيع أقلمة النباتات النسيجية مع الظروف الطبيعية وتتابع نموها في شروط طبيعية بعد نجاح عملية التقسية.

يجب توافر بيت زجاجي مجهز بكافة أجهزة التحكم بالحرارة والتهوية والرطوبة والإضاءة والتغذية المعدنية، ومعزول بشكل جيد عن الوسط الخارجي لمنع دخول الحشرات إلى داخله. يفيد البيت الزجاجي في عملية التقسية للنباتات النسيجية Vitoplants، وفي عملية تربية الأمهات المراد إكثارها بالنسج.

تختلف مكونات زراعة الانسجة النباتية بحسب التقانات المتبعة وحسب الهدف من زراعة النسج وحسب الغرض من انشاء المخبر هل هو بحثي او انتاجي، وحسب الانواع النباتية والاعداد المراد انتاجها.