طريقة تطعيم الموالح القمي المعملي (Invitro Shoot-Tip Grafting (STG

قام (1976) Navarro باستخدام طريقة التطعيم القمي للتخلص من الفيروسات ومشابهاتها وذلك على النحو التالي:

أ- تجهيز الأصل:

زراعة بذور الترويرسترانج في المعمل بعد تقشيرها وتطهيرها في محلول هيبوكلوريد الصوديوم بتركيز 0.5-0.7 % لمدة 10 دقائق مع استخدام مادة 20-Tween كمادة ناشرة بتركيز 0.1 % ثم تزرع كل بذرة في أنبوبة اختبار مقاسها x 2.5 15 سم وتحتوي على 25 سم3 بيئة Murashige Skoog وتوضع الأنابيب على درجة حرارة 27 م لمدة أسبوعين في الظلام التام وبصفة عامة وجد أن متوسط طول الشتلة 3-5 سم ومتوسط قطرها 1.6-1.8 مم يعطى أفضل النتائج في التطعيم القمي ويتم الوصول إلى هذا الحجم بعد 12 - 16 يوم على درجة 27 م ويمكن حفظ شتلات الأصل عندما تصل إلى هذا الحجم المناسب على درجة حرارة 4م لمدة أسبوعين على الأقل بدون تأثير على نسبة النجاح للتطعيم إذا كانت الطعوم غير جاهزة.

ب- تجهيز الطعم:

يتم تجهيز الطعم من عدة مصادر إما من الأشجار المنتخبة مباشرة بإزالة الأوراق من بعض الأفرع الصغيرة التي عمرها حوالي عام فتخرج بعد فترة نموات حديثة تجمع عندما يصل طولها إلى حوالي 3 سم أو أقل ولكن الأفضل أخذ عيون طعم من الأشجار المنتخبة وتطعيمها في الصوبة بهدف إعداد المصدر الأولى الذي سيؤخذ منه الأفرع الحديثة النمو، كما يمكن الحصول على النموات الحديثة المطلوبة في المعمل والأفضل الاعتماد على الطريقة الثانية أو الثالثة حيث يتم إزالة الأوراق من الشتلة المطعمة وتوضع في صوبة دافئة وغرفة النمو وتخرج النموات الحديثة خلال 8-15 يوم على حسب درجة الحرارة وتجمع هذه النموات عندما يصل طولها إلى 3 سم أو أقل ويتم أخذ القمة النامية في المعمل بطول حوالي 1 سم فقط وتطهر بواسطة محلول هيبوكلوريد الصوديوم بتركيز 0.25 % مع مادة ناشرة 200-Tween بتركيز 0.1 % ثم تغسل بعد ذلك بالماء المقطر ثلاثة مرات. أما في حالة إنتاج النموات الحديثة في المعمل فيتم زراعة خشب الطعم في بيئة مغذية في أنابيب الاختبار على درجة حرارة ثابتة 32 م وفترة إضاءة 16 ساعة فتخرج النموات الحديثة الفتي تجرى عليها معاملات الأعداد السابق شرحها.

ج- التطعيم القمي الدقيق:

يتم إخراج شتلة الأصل من أنبوبة الاختبار داخل اللامينافلو ويقصر ساق الأصل بحيث يصبح طوله 1.5 سم فقط وكذلك يقطع الجذر بحيث يصبح طوله من 4-6 سم مع إزالة الأوراق الفلقية ويعمل بعد ذلك شق على هيئة حرف T مقلوبة في طبقة القشرة وذلك بعمل قطع رأسي عند قمة الأصل بطول 1 مم وشق أخر أفقي بطول 1-2 مم.

يتم الحصول على القمة النامية بحيث تشتمل على المرستيم القمي وثلاث أوراق أولية فقط بطول 0.1-0.2 مم مع إزالة باقي الأوراق الأولية وذلك تحت الميكروسكوب ثم توضع القمة النامية داخل الشق السابق عمله في الأصل.

يجب ملاحظة أنه كلما زاد حجم القمة النامية المستخدمة في التطعيم القمي كلما زادت نسبة نجاح التطعيم ولكن في نفس الوقت تقل فرصة التخلص من الأمراض، ولقد أوضحت النتائج أن أفضل حجم للقمة النامية هو 0.1-0.2 مم وهي عبارة عن المرستيم القمي والثلاثة أوراق الأولية الأولى أي أنه لا توجد أنسجة خشب في القمة النامية التي تم فصلها بهذا الحجم وبالتالي تنعدم إمكانية وجود الفيروس في هذا النسيج لأن الفيروس يتحرك من خلال أوعية الخشب وبالتالي لا يوجد على الإطلاق في المرستيم القمي.

د- زراعة النباتات المطعمة في المعمل:

تزرع النباتات في بيئة مغذية سائلة وتحفظ على درجة حرارة ثابتة 27م وإضاءة 16 ساعة في اليوم ويلاحظ بدء تكوين خلايا الكالوس بين الأصل والطعم بعد 3 أيام من إجراء (STG) وبعد 11 يوم من التطعيم يتم الاتصال بين أوعية الخشب في كلا من الأصل والطعم وتخرج من 2-4 أوراق للطعم بعد من 4-6 أسابيع من أجراء التطعيم وتنقل في هذه المرحلة في وسط زراعة لإجراء عملية الأقلمة والهدف من استخدام أصل الترويرسترانج الثلاثي الأوراق هو سهولة التعرف على نجاح عملية التطعيم القمي من عدمه حيث بمجرد خروج الأوراق الجديدة يمكن الحكم على نجاح عملية التطعيم حيث أنه في حالة النجاح تنمو أوراق الموالح العادية الناتجة من الطعم أما في حالة فشل عملية التطعيم تنمو أوراق الأصل الثلاثية.

هـ- الأقلمة:

يتم نقل النباتات المطعمة بعد ظهور ورقتين من أوراق الطعم على الأقل وذلك بعد 3-6 أسابيع من التطعيم في أصص بلاستيك بها وسط زراعة معقم بالبخار مع وضع الاصيص في كيس بلاستيك ويربط من اعلى النبات لحفظ الرطوبة وتوضع الاصص في مكان مظلل بالصوبة على درجة حرارة 18-25 م وبعد من 8-10 أيام يتم فتح الكيس وبعد من 8-10 أيام أخرى يتم أزالته. وتصل نسبة نجاح عملية الاقلمة بهذه الطريقة لأكثر من 90%.