المشاكل التي تواجه مزارع الأنسجة النباتية

اولا: التلوث Contamination

يُعتبر التلوث الفطري والبكتيري من أهم المشاكل التي تقابل مزارع الأنسجة النباتية والتي تمثل عقبة كبيرة في سبيل الحصول على مزارع نظيفة خالية من التلوث الميكروبي، ولذلك وجب وضع بيان عن المشاكل والأسباب التي تؤدي للتلوث ومحاولة التغلب عليها مع اتباع طرق منع التلوث مثل التأكد من سلامة أجهزة تعقيم البيئة (الضغط – درجة الحرارة – الفترة اللازمة للعقيم)، أجهزة الهود – الفلاتر – ملابس الفنيين وغير ذلك (Boxus and Terzl, 1988, Herman, 2004, Odutayo et al., 2007)

 مصادر التلوث:

1- التلوث الناتج من المنفصل النباتي Explant، حيث التعقيم السطحي غير الجيد.

2- التلوث الناتج من الوسط الغذائي، حيث التعقيم غير الكفء في الأوتوكلاف.

3- التلوث الناتج من الزجاجيات وأدوات الزراعة.

4- التلوث الناتج من الأجهزة المستخدمة في تحضير البيئة.

5- التلوث الناتج من الجو المحيط من هواء وتراب وجراثيم البكتيريا والفطر.

6- التلوث الناتج من الحشرات – يمكن مسح الأرفف في غرفه التحضين بمبيد حشري مخفف.

7- التلوث الناتج من الفنيين العاملين في مجال زراعة الأنسجة. حيث يراعي النظافة العامة بالمعمل.

8- التلوث الناتج من الماء العادي غير المعقم.

9- استخدام محاليل تعقيم ليست بالتركيز الملائم أو فاقدة الصلاحية لزيادة فترة استخدامها أو من مصادر غير مضمونة.

10- المياه المستخدمة في غسيل النسيج غير معقمة.

11- التلوث الناتج من الكيماويات المستخدمة (من مصادر غير معروفة).

قد تكون البكتيريا ملوثة للمزرعة ولكن غير نامية وبالتالي غير مرئية وقد يكون عدم نموها راجع إلى وجود عوامل مثبطة في البيئة منها التركيز العالي من الأملاح والسكريات وحموضة البيئة غير الملائمة pH أو إفراز المنفصل النباتي المجروح مواد معوقة لنمو الميكروب. في بعض الأحيان يظهر التلوث بعد عدة نقلات في البيئات الجديدة مما يؤدي إلى خسائر وفقد للمزارع بأكملها وخاصة في المعامل التجارية التي قد لا تستطيع تفسير هذا التلوث الفجائي الذي حدث. قد يكون مصدر التلوث هو الأنسجة الداخلية للجزء النباتي المزروع أي تلوث داخلي حيث يصعب دخول محلول التعقيم والوصول إليه وتساعد البيئة الغذائية الغنية على نمو هذه الملوثات ويلاحظ أن التلوث يبدأ من النسيج النباتي المزروع وينتشر بعد ذلك إلى عموم البيئة وذلك عند توافر درجة الحرارة الملائمة لنمو الميكروب وغالباً ما تكون هذه الملوثات راجعة إلى البكتيريا أو قد تكون فطريات وعائية. يمكن إرجاع ظهور هذه البكتيريا فجأة أيضا إلى أن الظروف الملائمة للنمو لم تتوفر في البداية ثم حدث تأقلم لهذه البكتيريا وتحور واستطاعت النمو والتكاثر في هذه البيئة الجديدة فغالباً في حالة البكتيريا وخاصة بعض الأجناس مثل Pseudomonas, Corynebacteria تحتاج إلى مغذيات مثل الببتون وأحماض أمينية ذات تركيب فراغي معين وقد تكون أيضاً أن النبات عند نموه في البيئة أفرز منشطا لهذه البكتيريا بدون قصد ناتج التمثيل الغذائي والأيض لهذا النبات.

قد يتعجب البعض أن تعمل الحشرات مثل العناكب الدقيقة mits والتربس وحتى النمل كما في بعض دول إفريقيا في نقل التلوث إلى داخل أوعية الزراعة في حجرة التحضين (1988.Blake) حيث تحمل على جسمها البكتيريا وجراثيم الفطر وتتنقل بها وما يدفعها إلى ذلك هو السعي إلى التغذية على محتويات البيئة لاحتوائها على السكر ومغذيات آخري. وقد يلاحظ عند الفحص للمزارع بالعين المجردة ظهور خط من التلوث الفطري أو البكتيري من بداية جدار الوعاء إلى الداخل وهذا التلوث لا يكون له علاقه بالنسيج المزروع وبعد ذلك يعم التلوث الوعاء نظرا لانتشار الجراثيم. ويمكن تلافي حدوث ذلك بمسح أرفف حجرة التحضين بتركيز مخفف من مبيد حشري ملائم.

ومن ناحية أخرى قد يرجع ظهور هذا التلوث إلى عدم كفاءة التعقيم للنسيج أو استخدام أدوات غير معقمة في جهاز ال Hood. وفيما يلي الاحتمالات المرجحة للتلوث المفاجئ في مزارع الأنسجة:

1- عدم كفاءة التعقيم ويتم فحص الأوتوكلاف والتأكد من درجة الحرارة والضغط بواسطة الفنيين المختصين بالصيانة وأيضاً هناك دلائل توضع مع التعقيم للتأكد من سلامة التعقيم على هيئة أوراق خاصة تتغير لونها بعد التعقيم الجيد.

2- قد يرجع السبب إلى وجود بكتيريا داخلية في النسيج الذي تم زراعته Explant استعادت نشاطها بعد فتره فظهر التلوث.

3- عدم الكشف الدوري علي الفلاتر في الـHood وعدم الاعتناء بالتعقيم السطحي لمنضدة الجهاز.

4- عدم التعقيم الجيد للأدوات المستخدمة في النقل.

5- عدم الفحص الجيد للزراعات قبل النقل إلى بيئة جديدة ويمكن الاستعانة بعدسات مكبرة تحت إضاءة كافية للفحص الجيد للزراعات بواسطة فنيين مدربين.

وعلى العموم لا ينصح بإعادة تعقيم الأنسجة الملوثة ونقلها إلى بيئة جديدة أملاً في إعادتها إلى مراحل الإكثار والحل الوحيد هو التخلص من هذه التلوثات وإعدامها في الأوتوكلاف دون فتح الأوعية في الـ Hood.

أما إذا حدثت هذه التلوثات في المراحل الأخيرة وهي بعد تكوين الجذور فيمكن نقل هذه النباتات الملوثة بعد معاملتها بالمطهرات البكتيرية أو الفطرية الملائمة إلى الصوبة الزراعية لاستكمال مرحلة الأقلمة ثم التربية للنباتات مع التكهن بنسبه فقد للنباتات حسب شده التلوث.

إن حجرة فصل الأنسجة النباتية والتي تحتوي على جهاز Laminar air Flow Hood تكون فيها النظافة هي العامل المحدد والرئيس حيث يتم اجراء الاف النقلات للانسجة في جو معقم خال من الميكروبات.

شكل جهاز Laminar air Flow Hood

إن المشكلة الأساسية في الطرق المستخدمة فيها عمليات التعقيم أنه يتم التعامل مع أشياء تعتبر غير مرئية، وعلى هذا فإنه يجب أن يفترض أن جميع الأشياء مثل الملابس – جلد – الأجهزة – المعدات – الهواء – الأشخاص جميعاً غير معقمين أو مصدراً للتلوث والذي يحتوى على أكثر من جراثيم البكتيريا والفطريات وكثير من الأعداء غير المرئية وهي جاهزة لغزو المزارع النظيفة ومن المعروف أن البكتيريا تنتشر محمولة على الغبار بينما الجراثيم الفطرية تنتشر في الهواء لأنها خفيفة وعلى العموم ينصح أيضا بعدم استخدام المراوح الكهربائية بالمعمل وأيضا تجنب استخدام المكنسة الكهربائية في التنظيف.

هناك بعض النقاط التي يجب أن توضع في الاعتبار عند استخدام جهاز الـ Hood

1- الفلتر الذي يشكل العامل الأساسي في الجهاز يجب المحافظة عليه جيداً، حيث إنه ذات طبيعة هشة سهلة الكسر والتلف.

2- يستخدم في تعقيم منضدة الجهاز كحول الإيثانول أو الأيزوبروبانول ويجب الابتعاد عن استخدام الميثانول لخطورته على الإنسان.

3- يمكن استخدام اللهب الكحول في تعقيم الادوات داخل الجهاز ولكن يمكن - أيضاً استخدام جهاز تعقيم الأدوات الكهربائي مثل الـ Bacti – Cinerator وهو يقوم بالتعقيم على درجة مرتفعة جداً 1600 ف بلدة 5 ثوان وفي هذه الحالة يستخدم طقمان من الأدوات حتى نعطي فرصة لأن تبرد الأدوات بالقدر الكافي للاستخدام الامن.

4- الامتناع عن وضع أي عوائق بين فلتر الجهاز ومنطقة إجراء عمليات القطع ونقل الأنسجة داخله.

5- يجب الحرص على العمل قريباً من فلتر الجهاز وبعيداً عن جسم القائم بالعمل.

6- استخدام قفاز جراحي وكذلك تغطية الرأس والفم لمنع التلوث.

إضافة المضادات الحيوية للبيئة

تضاف أحياناً إلى البيئة الغذائية بعض المضادات الحيوية (الجدول ادناه) لإيقاف نشاط الكائنات الدقيقة وأهمها البكتيريا الموجودة بالجزء النباتي المزروع, 2001)  (Young et al,1984, O'Neilإلا أنه يجب الأخذ في الاعتبار أن هذه المركبات الكيماوية لها بعض الضرر لنمو الأجزاء النباتية وتكشفها ولذلك يفضل إضافتها فقط عند الضرورة كما أنه يجب أن يتم تعريف البكتيريا المسببة للتلوث قبل الشروع في اختيار المضاد الحيوي الملائم وأيضاً مراعاة التركيز الملائم لكل مركب حيوي وكما يحدث في حالة الاستخدام لفترة طويلة قد يتكون سلالات من البكتيريا تقاوم أنواع معينة من المضادات الحيوية.

يمكن اختيار المضاد الحيوي الملائم إضافته لنوع التلوث البكتيري عن طريق عزل البكتيريا ثم إعادة تخطيطها على سطح الأجار المغذي (بيئة نمو البكتيريا) ثم يوضع أقراص من ورق الترشيح المشبع بالمضادات الحيوية المختلفة ثم وضعها على طبق نمو البكتيريا وبعد التحضين يلاحظ الهالات الشفافة المتكونة وهذا دليل على عدم قدرة البكتيريا على النمو عند وجود المضاد الحيوي المعين والطريقة الثانية زراعة البكتيريا على بيئة أجار مغذي ثم تعريف البكتيريا النامية خلال الطرق المعملية المعروفة (طبقاً للصفات المميزة للجنس والنوع) ثم الرجوع إلى المراجع التي يتم من خلالها تحديد المضاد الحيوي الملائم إلا أن الطريقة الأخيرة تحتاج إلى معمل ميكروبيولوجي وأيضاً إلى فنيين مدربين لتعريف الأنواع البكتيرية Herman, 2004, Reed and Tanprasert, 1995)).

ويلاحظ أن مجموعة التتراسيكلين تمنع نمو البكتيريا بينما الإستربتوميسين يمنع تخليق البروتين في الخلايا البكتيرية والإرثروسين يمنع عملية النسخ في الخلايا. كما أن البنسلين والبولي مكسين يمنع تكوين الجدار في مراحل انقسام خلايا البكتيريا.

جدول يوضح تخصص أنواع المضادات الحيوية في مكافحة الكائنات الملوثة لبيئة زراعة الأنسجة

من الطبيعي عند أخذ القمم النامية من الأشجار أو النباتات التي تنمو في الحقول فإننا نتوقع نسبة عالية من التلوث حين زراعتها في البيئة الغذائية هذا بالرغم من التعقيم السطحي ومراعاة شروط التعقيم وقد تصل نسبة التلوث المتوقعة من 80-90٪ بينما تنخفض هذه النسبة إلى حوالي 60 ٪ عند أخذ نفس النوع النباتي من الأشجار أو العقل المزروعة في الصوبات الزراعية وأيضاً قد تصل النسبة إلى 40 ٪ حين نتعامل مع النباتات النامية في الحضانات.

هناك طرق وإجراءات أخرى لخفض هذه النسب من التلوث فمثلاً يمكن تغطية بعض الأفرع الصغيرة في الشجرة بواسطة كيس من البلاستيك الشفاف ثم أخذ النموات الجديدة داخل الكيس والبدء بها في الزراعات. أيضاً يمكن أخذ عقل وزراعتها في الصوبات والحضانات ثم رشها دورياً بالمبيدات الفطرية وأيضاً البكتيرية والحصول على النموات الجديدة. ويمكن أيضاً الإسراع في الحصول على نموات جديدة بالرش بمادة الجبريلين لإطالة هذه الأفرع المتكونة تحت ظروف الصوبة أو وضع النبات في الظلام في الصوبة وذلك لحث النبات على الاستطالة (etulation) وأخذ الأفرع والبراعم الجديدة. كل هذه الأساليب تؤدي إلى خفض نسبه التلوث لإنشاء مزرعة نظيفة.

تحسين طريقة التعقيم:

يمكن رفع كفاءة التعقيم السطحي للأنسجة النباتية باستخدام بعض الطرق التالية:

1- استخدام مضخة ماصة للهواء تعمل إما بالهواء أو بالكهرباء للتخلص من إلى جميع أجزاء النسيج.

2- إضافة مادة detergent مثل tween 20 أو الصابون لزيادة انتشار المحلول.

3- هز النسيج في المحلول باستخدام جهاز هزازShaker .

4- تكرار التعقيم عدة مرات.

5- الغسيل الأخير باستخدام تركيز منخفض من المطهر بدلا من المياه المعقمة قبل الزراعة.

ثانياً: ظهور اللون البني بمزارع الأنسجة النباتية:

يحدث تلوين للبيئة عند زراعة عدد كبير من النباتات وخاصة الأشجار والشجيرات طالما زرع المنفصل النباتي في البيئة، وينتج هذا التلوين من أكسدة المركبات الفينولية عند تفاعلها مع مكونات البيئة ويتحول اللون إلى بني أو أرجواني حول النسيج وقد ينتشر في البيئة Compton and Preece, 1986).)

شكل يبين المزارع النسيجية يظهر بها التلوث الفطري والبكتيري

شكل يبين مظهر التلون البني في مزارع انسجه الفول Vicia faba

ويوجد مدي واسع من المركبات الفينولية في النبات وهذه المركبات موجودة في كل من النسيج النباتي وفي بعض النباتات تقع هذه المركبات في خلايا خاصة تسمي Tanin Idiblasts أو في الفجوات الخلوية Vacuoles ومعظم المواد الفينولية إما أن تكون:

1. فلافونيد مع مجموعة هيدروكسيل لمجموعة فعالة.
2. مركبات محتوية على حلقة عطرية بها ٦ ذرات كربون ومجموعة جانبية على الحلقة محتوية على واحد أو ثلاث ذرات كربون والمحتوية على مجموعة كربوكسيل نشيطة.

وتزيد المركبات الفينولية نمو الخلية وتقلل من تخليق البروتين ووجود مزيد من السكر في بيئة الزراعة يساعد على زيادة تخليق المركبات الفينولية. وهذه المركبات هامة للنبات وتتأكسد لتكوين كينون الذي يتبلمر بسرعة ويرتبط بالبروتين. وتمنع مركبات البولي فينول إزالة مجموعة الكربوكسيل الموجودة في إندول حامض الخليك "IAA" ولذلك يشجع النمو، بينما تشجع الفينولات الأحادية إزالة مجموعة الكربوكسيل وهذا يفسر أهمية الدور الذي تلعبه الفينولات في الاتزان الهرموني للنباتات.

والفينولات هامة أيضاً بالنسبة للجروح في النباتات فهي تمنع إصابة المناطق المجروحة من العدوى أو التلف وميكانيكية هذا غير معروفة حتى الآن – وفي مزارع الأنسجة النباتية تتأكسد الفينولات بواسطة إنزيمات البيراكسيديز أو بواسطة إنزيمات البولي فينول أكسيديز والمركبات المتأكسدة تثبط النشاط الإنزيمي وتؤدي إلى موت المنفصل النباتي وهذه تسمى بمصطلح تثبيط ذاتي أو تلقائي "auto inhibition" لأن المنفصل النباتي يثبط نموه ويتوقف هذا على ماهية هذه المركبات وكيفية تأثيرها على الأنسجة وأثرها وتأثيرها على الأنسجة التي حولها مما يؤدي إلى تدهور الأنسجة وتلوينها باللون البنى وتموت (Compton and Preece, 1986; Debergh and Zimmerman, 1991)

ويلاحظ الآتي:

1- الأجزاء النباتية من النباتات الحديثة النمو تحتوي أنسجتها على تركيبات فينولية أقل من الكبيرة السن.

2- تركيز الفينولات في الساق الكبيرة في السن أعلى عدة مرات من الصغيرة وكذلك القمة النامية.

3- تنتج الزراعات الجديدة (الموجودة في بيئة البداية) مواد فينولية أكثر من تلك الزراعات الموجودة في مراحل التضاعف.

4- بعض أصناف النباتات تحتوي على مركبات فينولية أكثر من الأخرى.

5- مكونات البيئة لها تأثير كبير على إنتاج المركبات الفينولية في مزارع الأنسجة النباتية.

الطرق المتبعة لتقليل المواد الفينولية بالبيئة:

1- صغر المنفصل النباتي فيجب أن يكون الجزء المجروح صغيراً بقدر الإمكان في المنفصل النباتي حيث تستخدم أدوات حادة جدا للقطع.

2- استخدام مضادات الأكسدة إما بنقع الأجزاء النباتية فيها أو في البيئة أو كليهما معاً حيث إن مضادات الأكسدة لا تمنع تكوين المواد الفينولية ولكنها تمنع بلمرتها (بلمرة الكينون) وهذا يقلل الفرصة للفينولات للتفاعل مع البروتين. كما يلاحظ أن بعض المواد المضادة للأكسدة أحسن من الأخرى.

المواد المستخدمة للتقليل من عمليات الأكسدة:

1. بولي فينيل بيروليدون.
2. سيستين هيدركلوريد.
3. حامض الستريك.
4. حامض الإسكوربيك.

تقليل الأملاح في البيئة:

من المعروف أن البيئة ذات التركيز المنخفض من الأملاح يقل بها المواد الفينولية كما أن خفض معدل النيتروجين في البيئة يؤثر على مستوى المواد الفينولية ويحد منها.

تأثير منظمات النمو في البيئة:

تعمل منظمات النمو وخاصة الأوكسين والسيتوكينين على زيادة مستوى المواد الفينولية، وعند إزالتها من البيئة أو تخفيض التركيز تتحسن النباتات حيث يأخذ المنفصل النباتي الفرصة لخفض مستوى المواد الفينولية ثم ينتقل بعد ذلك إلى بيئة تحتوي على منظمات النمو.

دور الفحم المنشط:

يساعد الفحم النباتي النشط على تقليل كمية المواد الفينولية المفرزة في البيئة وذلك

بإدمصاصها كما يدمصب بعض مركبات البيئة وخاصة الهرمونات.

مستوى الإضاءة:

إن خفض مستوى الإضاءة يقلل من تحليل المركبات الفينولية والدراسات على هذا

الموضوع قليلة وربما لا يكون للإضاءة تأثير كبير.

نقع المنفصل النباتي:

وذلك في ماء معقم لعدة ساعات بعد فصله ثم يلي ذلك زراعته في بيئة تحتوي على

القليل من الأملاح لخفض تأثير المركبات الفينولية.

النقل السريع للنبات:

وذلك بنقل النسيج إلى بيئة طازجة على فترات متقاربة حتى يمكن تقليل التلوين ولكن هذه الطريقة مكلفة إلى حد كبير حيث يزيد من استهلاك البيئات المغذية وما يتعلق بها من عمليات الإعداد.

مما سبق نرى أن هناك معاملة أو أكثر من المعاملات سابقة الذكر تصلح للتغلب على مشكلة المواد الفينولية، وفي معظم الحالات هذا النوع من مشاكل التلوين تتأثر بطرق الحل السابقة.

ثالثا: احتراق القمة النامية Shoot tip Necrosis - Tip burn

يعتبر احتراق القمة النامية من العيوب الفسيولوجية الشائعة المتعلقة بمزارع الأنسجة النباتية، حيث يحدث اصفرار للقمة ويؤدي في النهاية لاحتراق القمة النامية وموتها، ويشجع ذلك على نمو البراعم الجانبية.

ويؤثر احتراق القمة تأثيراً واضحاً على نباتات البطاطس النامية في الأنابيب أو أوعية الزراعة، ولقد قام العالم Sha وآخرون عام ۱۹۸۵ بدراسة تأثير الكالسيوم بتركيزات مختلفة (0.3 ، 3 ، 30 ملليمول كالسيوم) على احتراق القمة النامية، وكذلك تأثير التهوية، ولقد وجد أن زيادة تركيز الكالسيوم في البيئة يقلل حدوث احتراق القمة النامية، وقد اقترح العلماء. أن استخدام الأغطية الشديدة الإحكام لأوعية الزراعة يعمل على تراكم الغازات ويقلل معدل التنفس ويقلل أيضاً معدل الأنشطة الأيضية الأخرى حيث تتراكم الأحماض الأمينية والاوكسالات وفي هذه الحالة تتحد الاوكسالات مع الكالسيوم وتجعله غير ميسر للنباتات ويعمل ذلك على نقص الكالسيوم بالنبات، وبالاضافة لذلك فلقد وجد أن معدل النتح يقل في الأوعية المحكمة الغطاء (Donnelly and Vidaver, 1984b) حيث يبطئ انتقال الكالسيوم للأنسجة النامية، ولعلاج هذه الظاهرة فلقد نصح العلماء بالآتي:

1- زيادة تركيز الكالسيوم في البيئة.

2- زيادة التبادل الغازي في أوعية الزراعة باستخدام فلاتر في أغطية الأوعية.

ولقد لوحظ احتراق القمة النامية في نباتات الكرنب الصيني نتيجة لنقص عنصر الكالسيوم. ويعالج احتراق القمة النامية بالنسبة لنباتات الكرنب النامية في الصوبات باستخدام أوعية زراعية مغطاة بأغطية تسمح بالتبادل الغازي مما يساعد على زيادة

الكالسيوم في البيئة ويسمح بارتفاع محتوى الكالسيوم إلى حدود 5٪ للوزن الجاف .(Kataeva et al, 1991)

رابعاً: الظاهرة الزجاجية (التزجزج): Vitrification

لوحظ بعض المشاكل الفسيولوجية لمحاصيل الصوبات فيما يسمى بالظاهرة الزجاجية أو الزجزاجه أو البلل بالماء أو يمكن استخدام لفظ الهشاشة (1991.Ziv)، وتزيد هذه الظاهرة خصوصا عند نقص الكالسيوم، وتزيد عامة بالعوامل التي تساعد على زيادة نمو المجموع الجذري على حساب المجموع الخضري (Van Berkel, 1981) وفي المعمل بين العالم (1983,Debergh) بأن هذه الظاهرة تؤدي إلى استطالة النباتات ويعقب ذلك زيادة الماء حيث تكون عصيرية وتتميز بالهشاشة ثم أخيرا تصفر النباتات أو تكون شبه شفافة، حيث بين ديبرج أن العوامل الآتية تؤثر على تكوين هذه الظاهرة:

1- نوع النبات المأخوذ منه المنفصل النباتي Donor plant.

2- حجم وعاء الزراعة لوحظ أنه كلما كان كبيرا قلت الظاهرة.

3- نوعية البيئة – صلبة أم سائلة.

4- المعاملة بدرجات الحرارة المنخفضة 3–4 م.

5- تركيز النترات والكلوريدات والكالسيوم في البينة.

6- السيتوكينين: نوعيته وتركيزه - فلقد وجد آن ازالة البنزيل آدينين من البينة يقلل من تكوين هذه الظاهرة.

7- استخدام السيكوسيل في البينة آو مضادات الاوكسينات.

8- تركيز الكربوهيدرات.

شكل يبين ظاهرة Vitrification في نبات العنب بالمقارنة بالنمو السليم

ولقد بين العالم البلجيكي ديبرج (1992 , (Debergh et alان مادة الاجار هي المسئولة عن الظاهرة الزجاجية حيث إنها تؤثر على جهد الماء، وكان تصحيح تركيزات الأجار في البيئة العامل الحكم في علاج هذه الظاهرة حيث لوحظ أنه بزيادة كمية الأجار تقل الظاهرة الزجاجية (Vitrification) ولقد وصف أن أوراق النباتات ذات الظاهرة الزجاجية بأنها عريضة وسميكة وعصيريه وغضة أو متجعدة ذات تشوهات واضحة وذلك من خلال نقص عمليات اللجنة للأوعية والخلايا وكذلك تضخمها، كما لوحظ أن النباتات الملجنة يزيد فيها نشاط إنزيمات بيراكسيديز، بينما يقل نشاط إنزيمات الفينيل الأنيين أموينوم ليز "PAL" وكذلك يقل تكوين الفينول.

ولقد لوحظ أن الزراعات المعملية التي وضعت تحت ظروف الضغط المنخفض وزيادة السيتوكينين آو زيادة أيونات الأمونيوم تؤدي إلى زيادة إنزيمات البيراكسيديز والتي تؤدي إلى زيادة إنتاج غاز الإيثيلين الذي يتراكم في أوعية الزراعة خاصة إذا كانت هذه الأوعية محكمة الإغلاق، وتعمل إنزيمات الأكسدة الحيوية (البيراكسيديز) في الخطوة النهائية لتخليق الإيثيلين، وإذا ثبط الناتج النهائي فإن ذلك يعمل على تقليل إنتاج الإيثيلين وكذلك يقل إنزيمات الفينيل الأنين آمونيوليز "PAL" كذلك إنزيمات الأكسدة الحامضية ""acidic peroxidases وبالتالي يثبط تكوين اللجنين بالجدار الخلوي، ويكون تخليق اللجنين والسليولوز مصاحباً بنقص نسبة الكربون إلى النيتروجين، وأن النقص في اللجنين والسليولوز يسمح بصعود وانتقال مياه أكثر للخلايا وهذا يرجع إلى النقص في الضغط الجداري وزيادة النفاذية، ويظهر ذلك في صورة تشوهات في النباتات المزجزجة ""vitrous plants.

ولقد درس العلماء تأثير إضافة المواد الفينولية للبيئة، وذلك لأن تخليق المركبات الفينولية ذات علاقة بنسبة الكربون إلى الهيدروجين، فلقد وجد أن إضافة الفلوريدزين تقلل من تكوين الظاهرة الزجاجية في النباتات وكذلك درس العلماء تأثير المعاملة بدرجات الحرارة المنخفضة وكذلك معاملات التجذير على نشاط العديد من الإنزيمات.

وقد وجد أن انزيم flavone Synthase هو فقط الذي لا يقل في النباتات المزجزجة، ومع الوقت يزداد نشاط الإنزيم. ولقد لوحظ أن بعض النباتات تنمو تحت ظروف تكوين الظاهرة الزجاجية، ولكن ربما النقص يكون راجعا لاستنفاذ المواد التي يعمل عليها الإنزيم من خلال تقليل إنزيمات الـ

 1- P. coumarate: CoA ligase. 2- Hydroxy-Cinnamate: CoA ligase.

ويلاحظ أن كل النشاط الإنزيمي يزداد في النباتات المكونة للجذور.

ويحول الفلوريديزين الي باراكوماريل كوا CoA وذلك بانزيم flavonsynthase والذي يستخدم كبادئ لتخليق اللجنين، وهذا المركب موجود بقلة في النباتات النامية بالمعمل بسبب نشاط انزيمات P. Coumarate CoA legase" ويشجع الفلوريديزين أيضاً انزيمات "PAL" وكذلك hydroxy cinnamate CoA ligase والمعاملة بالبرودة ليست مثل الفلوريديزين حيث انها تفيد لفترة بسيطة الا آن ميكانيكية عمل البرودة وتأثيرها على الظاهرة الزجاجية غير معروف حتى الآن.

شكل يبين تأثير تراكم غاز الإيثيلين في الأنبوب على مظهر وطبيعة نمو نبات البطاطس ويعالج بتوفير التهوية الملائمة أو إضافة مادة Silver thiOSulphate

في مقارنة لأفرع نبات الكريزنثم التي تحتوي على ظاهرة التزجزج vitrification وأخرى ليس بها هذه الظاهرة أظهرت فروقاً معنوية في القدرة على التمثيل الضوئي لنقص في الكلوروفيل بأنواعه المختلفة وأيضا في تمثيل البروتين والسكريات Qing- Chun et al.2009))

وفي دراسة آخري لبعض النباتات النادرة في أستراليا مثل Eremophila sp, Eucalyptus-Gypsophila sp اشارت الدراسة التخلص من هذه الظاهرة عن طريق التهوية أثناء نمو النباتات في أوعيه الزراعة Rossetto et all 1992. Dillen and Buysens, 1989

شكل يبين استخدام أوعيه الزراعة التي تسمح بتبادل الغازات والتهوية

أوضح بعض العلماء تأثير إضافة السيتوكينين في إحداث ظاهرة التزجزج في الزراعات المعملية للشمامLeshem et al, 1988) )

خامسا: الاختلافات الوراثية Somacional Variation

من المعروف حالياً أن هناك اختلافات وراثية تظهر في الخلايا غير المتشكلة (الكالوس) وكذلك البروتوبلاست والأنسجة المختلفة أيضاً في الصفات المورفولوجية للنباتات الناتجة. ومعظم الاختلافات الوراثية قد ترجع إلى التغيرات في عدد وتركيب الكروموسومات.

وبصفة عامة فإن هناك أنواعاً من التغيرات في مزارع الأنسجة قد تختفي لأن الخلايا تميل إلى الحصول على ثبات وراثي في المزارع. أشارت الأبحاث الحديثة حالياً إلى أن مزارع الخلايا أو الأنسجة تمر بعدة تغيرات وراثية منها polyploidy و aneuploidy والطفرات والنقص والانتقال في الكروموسومات وأن هذه أيضاً تورث علي المستوي الكيميائي والجزيئي. والاختلافات الوراثية في المزارع تورث على شكل صفات مختلفة تظهر على النباتات الناتجة والتي تورثها إلى النسل الناتج عن طريق التكاثر الجنسي أو التكاثر الخضري (Skirvin and Janick, 1978; Shang, 1984)

الأشكال المختلفة Variants المنتخبة من مزارع الأنسجة يشار إليها تحت اسم Calli clones من مزارع الكالوس أو يشار إليها تحت اسم proto clones من مزارع البروتوبلاست. ولكن الباحثين (1981.Larkin & Scowcroft) أعطى إليها التعبير Somaclonal Variation للأشكال المختلفة للنبات الناتج من مزارع الخلايا أو النسيج النباتي بينما علماء منهم (Evans et al., 1984) اقترح الاصطلاح variation gametoclonal  للاختلافات الناتجة من مزارع الخلايا إلا أن المصطلح الاول somaclonal variation  يعتبر الاكثر قبولا في مجال زراعة الأنسجة النباتية.

ويمكن الاستفادة من الاختلافات الوراثية التي تظهر على النباتات الناتجة من زراعة الخلايا الجسمية على بيئة غذائية داخل المعمل in vitro ومن الممكن إحداث تغييرات وراثية بمعدلات عالية في الأصناف الاقتصادية بدون اجراء تهجينات مع تراكيب ورائية آخري وبالتالي ممارسة إجراء عملية الانتخاب بين النباتات الناتجة. وقد استخدم إحداث الطفرات معملياً في تحسين محاصيل عديدة Novak and Brunner, 1992,Encheva et al.2003) )

تفسير نشأة الاختلافات الوراثية Somaclones

لقد تم نشر عدد من الاحتمالات بواسطة كثير من الباحثين لتفسير نشأة الاختلافات الوراثية بين النباتات الناتجة من زراعة الخلايا الجسمية (الأوراق الفلقية، الجذر، الساق، مزارع البروتوبلاست) ويمكن تلخيص هذه الاحتمالات في النقاط التالية:

1- طفرات جينية.

2- تغيرات في أجزاء الكروموسوم.

 أ- النقصDeletion

ب- الإضافةDuplication

3- تغييرات ترتيبية لالجينات علي الكروموسوم وتشمل:

أ- الانتقالات الكروموسومية

ب- الانقلابات الكروموسومية.

4- تغيرات عددية في المجموعة الكروموسومية وتشمل:

أ- عديدة الانويةPolyploidy

ب- وحيد النواة Aneuploidy.

التغيرات على مظهر النباتات الناتجة

أشار عديد من العلماء والباحثين إلى أن النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة بغض النظر عن مصدر النسيج أو الطريقة المتبعة للحصول عليه أن هذه النباتات قد تكون مختلفة من ناحية المظهر الخارجي (1978 ,Skivuin and Janick). قد يكون الاختلاف في لون وشكل الزهرة، انظر الشكل التالي كما قد يحدث في تركيب ووظيفة الثغور بالنباتات كما بالشكل ادناه.

شكل إحدى الاختلافات المظهرية التي يمكن الاستفادة بها في مجال نباتات الزينة

بعض الباحثين قد حصلوا على نباتات كثيفة الأغصان بطيئة النمو مع زيادة انتصابها وبعضها كانت قصيرة ذات أوراق سميكة وقوية مع وجود كثافة عالية للشعيرات على بشرة الورقة. إن على الباحثين في مجال زراعة الأنسجة أن يعطوا اهتماما لمثل هذه التغيرات ولا يعتبر هذا في جميع الأحوال تغيرات طارئة أو مرحلية فمن الممكن الاستفادة منها في بعض الأحوال وخاصة في مجال نباتات الزينة للحصول على أصناف جديدة (انظر الشكل السابق).

الاختلافات الكبيرة قد ظهرت على حجم نبات الجيرانيوم النامي بطريقة زراعة الكالوس وكذلك اختلافات في شكل كل من الورقة والزهرة وتحتوي الزهرة من الزيوت وصبغة الأنثوسيانين وأن هذه الاختلافات تباينت باختلاف الصنف وعمر نسيج الكالوس. وعند زراعة النسيج Subculture فإن هذه الاختلافات قد اختفت تدريجياً في بعض الأحيان. وقد حدث ذلك أيضا في نباتات السنجونيم حيث ظهرت نباتات بيضاء اختفت بعد فترةNasr El Din et al, 1978) )

إن هذه الاختلافات يعتقد أنها ناتجة من وجود أنسجة كيميرا Chimera (أنسجة مختلطة) وتغير العدد الكروموسومي نتيجة لفقدان أو إضافة أحد الكروموسومات أو

نتيجة طفرة وراثية حدثت لأحد النباتات.

يظهر شكل الثغور الطبيعية (۱) والثغور غير الطبيعية (۲)

وذلك باستخدام الميكروسكوب الالكتروني الماسحscanning electron microscope

وعلى النقيض من ذلك فإن ظهور اختلافات مظهرية على النباتات التي يتم إكثارها

بغرض الإكثار الدقيق مثل الموز والفراولة والنخيل فهي ينبغي أن تكون مطابقه للأصل وأن تكون مثل هذه الاختلافات في أضيق الحدود.

شكل يبين الاختلافات المظهرية لنباتات الموز الناتجة عن الإكثار الدقيق في المعمل وفي صوبات التربية

قسم 2003 ,Ibrahim الاختلافات المظهرية في نباتات الموز الناتج عن الإكثار الدقيق إلى أربع مجموعات: المجموعة الأولى تشمل تغير في الحجم الطبيعي للنباتات سواء كانت بالتقزم أو زيادة في طول النباتات. المجموعة الثانية يندرج تحتها تغير في شكل الورقة وتشوهها وعدم تماثل نصفي الورقة. المجموعة الثالثة يحدث بها تغير في اللون الطبيعي للورقة فيظهر موزيك بالورقة وهو غير ما قد يسببه المرض الفيروسي أو زيادة في صبغة الأنثوسيانين. المجموعة الرابعة تغير في لون الساق الكاذبة وقد تتحول إلى اللون الأسود. وقد أرجعت الدراسة السبب في الاختلافات المظهرية إلى زيادة عدد مرات الإكثار المعملي Subcultures ولزيادة تركيز BA في البيئة وأوضحت الدراسة أيضاً أن صنف الموز واليمز Williams أكثر ثباتاً من ناحية التباين الوراثي عن صنف جراندنان. وقد أحصى خمسة وعشرون اختلافاً مظهرياً في نبات الموز ناتج زراعة الأنسجة وخلال متابعة الناتج في الحقل فقد يرتد البعض والبعض الآخر يظل كما هو فلابد من إقصائه في الزراعات التجارية حيث يؤثر معنوياً على كمية وجودة المحصول (2011 ,El-Shahed). وقد أرجع البعض زيادة حدوث الاختلافات إلى زيادة تركيز منظمات النمو في البيئة وخاصة السيتوكينين (Brained and Fuchigami, 1982, Debergh et al., 1992, Ibrahim, 1999,

وعلى النقيض من ذلك فقد ذهب 2007. Venkata إلى أن زيادة السيتوكينين في بيئة الموز لم تؤدي إلى أي اختلافات في الموز الناتج.

و من ناحيه آخري عند اكثار بنجر السكر معملياً بواسطة زراعة الأنسجة أظهرت النتائج مطابقة النباتات الأصلية وناتج زراعة الأنسجة عند استخدام تحليل RAPD سواء كان هذا الإكثار بطريقة مباشرة أو غير مباشرة (من خلال الكالوس) وقد تطابقت هذه النتائج مع تحليل البروتين لنفس النباتات.

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.