معلق الخلايا Cell suspension
المؤلف:
أ.د. محمود توفيق شرباش
المصدر:
اساسيات زراعة الانسجة النباتية
الجزء والصفحة:
ص 66-72
2025-11-04
35
معلق الخلايا Cell suspension
تحضير معلق الخلايا
يحضر معلق الخلايا بزراعة خلية فردية أو مجموعة من الخلايا في بيئة سائلة لا تحتوي على آجار بهدف تفكيك وإكثار الخلايا، ويمكن المساعدة في تفكيك الخلايا بالضغط الخفيف على الجزء النباتي الغض أو أجنة أو كالس باستخدام قضيب زجاجي ثم زراعتها في بيئة سائلة. وتستخدم دوارق مخروطية لها زوائد أنبوبية جانبية تحتوي على بيئة سائلة. وتزرع الخلايا النباتية أو أجزاء من الكالس داخل الزوائد الأنبوبية وتثبت الدوارق على قرص دوار يتحرك بسرعة دورة واحدة / الدقيقة. وبذلك تتكاثر الخلايا ويزداد عددها في البيئة بعد فترة من الحركة المستمرة (Steward. and Shantz1956). ويستخدم في ذلك جهاز هزاز ذات مسطح مستو . وتنمو الخلايا وتتكاثر مع استمرار رج البيئة السائلة أثناء فترة الحضانة التي تستغرق 21 - 28 يوما مع المحافظة على تبادل الغازات وتجانس توزيع الخلايا في الوسط الغذائي. لذلك فإن دراسة مكونات البيئة السائلة والمحافظة على حموضتها في اتجاه نقطة التعادل لها أهمية كبيرة في تسهيل تجزئة وتفكيك خلايا الكالس المتجمعة وتجانس انتشار الخلايا وتماسها المباشر مع البيئة السائلة.
تثبيت الخلايا في البيئة السائلة
يمكن تنشيط النمو في بيئة سائلة بدون استخدام أية وسيلة للتثبيت، حيث تغمس الخلايا والأنسجة في بيئة غذائية مع استمرار الرج بهزاز كهربائي لتوفير التهوية الجيدة. وفي حالة عدم توفير جهاز الرج يمكن استخدام إحدى الطرق الآتية لتثبيت الخلايا:
1- استخدام ورق ترشيح خال من الرماد Ashless filter paper
تعلق كبار من ورق الترشيح فوق سطح بيئة سائلة غير متحركة. ثم تثبت الأجزاء النباتية أو التجمعات الخلوية المتعددة على السطح العلوي لورقة الترشيح. ويساعد ورق الترشيح على إمداد الخلايا أو الجزء النباتي بالبيئة الغذائية ويحافظ على إبقائها في الهواء فيسهل لها تبادل الغازات.
2- استخدام قطع اسفنج Viscose sponge تحت ورق ترشيح
تستخدم كبار من ورق الترشيح كحامل للمادة النباتية. ويضاف قطعة اسفنج تحت ورقة الترشيح. وفى هذه الطريقة يمكن إعادة استخدام المواد المستعملة، وإجراء الزراعة الثانوية بعد تغيير البيئة الغذائية وبدون تغيير الإناء المستخدم في الزراعة. وتسهل هذه الطريقة فحص النموات واستبعاد غير الصالح منها، ويمكن نقل البادرات الناتجة بسهولة إلى التربة كما تتميز بأنها تحتاج إلى كميات أقل من المواد الغذائية.
3- الخمس Embedding
تغمس الخلايا أو البروتوبلاست في مركبات مثل جيل بوليمر Polymeric gel أو جيل الجينات الكالسيوم Calcium alginate gel أو Agar أو Agarose. ويعتبر الجينات الكالسيوم من المركبات غير السامة بينما Polyacrylamide غالبا تكون سامة ولا يفضل استخدامها.
4- الاصطياد الداخلي Entrapment
تستخدم في هذه الطريقة مناخل أو أغشية ليفية مسامية Hollow fiber membrane أو فومات مسامية Pre - formed plastic foams أو صوف زجاجي Glass wool أو صوف صخري Rock wool . كذلك تستخدم ألياف أنبوبية مصنوعة من خلات السليلوز Cellulose acetate أو سليكون متعدد الكربونات Silicone polycarbonate. وترتب هذه الأغشية على هيئة حزم متوازية عند طرف الألياف الأنبوبية المحتوية على الخلايا، فيتم اصطياد الخلايا في المسافات البينية للأغشية الليفية وتمر البيئة الغذائية السائلة في فراغات الألياف. وتستخدم شبكة من مادة Polyurethane foam لاصطياد الخلايا حيث تنمو في صورة تجمعات خلوية مع الاحتفاظ بحيويتها كاملة.
5- التثبيت على كرات زجاجية
تعلق الخلايا على كرات زجاجية داخلها فجوة هوائية تساعدها على الطفو فوق البيئة السائلة.
الزراعة الثانوية لمعلق الخلايا
عندما يصل أحد العناصر المكونة للبيئة الغذائية إلى مرحلة الاستنزاف يصبح هو المتسبب في انخفاض سرعة نمو وانقسام الخلايا، وتكون هذه الفترة هي المناسبة للبدء في الزراعة الثانوية المتكررة للخلايا. وتتم الزراعة الثانوية باستخدام ماصات أو حقن لنقل أحجام محددة من معلق الخلايا إلى بيئة سائلة طازجة تحتوي على نفس المكونات للبيئة السابقة. ويفضل أخذ الكميات المطلوب زراعتها من السطح العلوي لمعلق الخلايا.
مراحل انقسام الخلايا المعلقة
1- مرحلة تلكؤ الانقسام The lage phase
يحدث عقب الزراعة في بيئة سائلة دخول الخلايا في مرحلة سكون حركي مع زيادة نشاط فسيولوجي. وتبدأ هذه المرحلة بسلسلة من عمليات التمثيل الغذائي تتهيأ بعدها الخلايا للانقسام الميتوزي، ويحدث أثناء مرحلة التمثيل الغذائي زيادة القدرة الاختزالية وإنتاج مركبات ATP والكربوهيدرات كمصدر للطاقة. لذلك يعتبر إضافة السكروز للبيئة هاما جدا كمصدر للطاقة. حيث يتم أكسدة السكروز بواسطة دورة تحلل الجلوكوز Glycolysis ودورة البنتوز Pentose Phosphate pathway ودورة حمض تراي كربوكسيليك Tricarboxylic acid وتزداد سرعة تمثيل البروتينات والأحماض النووية. كما تتأثر بشدة حالة ثبات مستوى إنزيم mRNAs بما تحتويه البيئة الغذائية من الأكسين ونشاط إنزيم Phenylala nine ammonia lyase
2- مرحلة انقسام الخلايا Cell division phase
في هذه المرحلة تبدأ الخلايا في الانقسام وتستمر في الانقسام حتى يصبح واحدا أو أكثر من عناصر البيئة هو السبب في بطء أو توقف الانقسام. وفي تجربة زرعت خلايا القمة النامية لنبات الخرشوف Jerusalem artichoke وحضنت عند 25 م. وبعد سبعة أيام زاد عدد الخلايا بمقدار 10 أضعاف العدد الذي بدأ به. وخلال هذه الفترة زادت كمية الأكسجين المستهلك في التنفس، وزاد ثبات الحمض النووي RNA خلال ثلاثة الأيام الأولى من الزراعة المعملية، وزادت سرعة تمثيل البروتين نسبيا وانخفاض المواد الثانوية الممثلة مع تغير بسيط في حجم الخلايا وتميزت باحتوائها على فجوات صغيرة ولم يحدث لها تكشف.
3- مرحلة الثبات العددي Stationary-phase
تنخفض بوضوح سرعة انقسام الخلايا عندما يصل كثافتها مرحلة الثبات العددي في البيئة السائلة، وينخفض تنفسها وتمثيل الحمض النووي RNA وتمثيل البروتين مع زيادة عدد الخلايا المحتوية على فجوات عصارية. ويرتبط توقف الخلايا عن الانقسام بزيادة تجمع بعض المركبات الأيضية الثانوية مثل بعض القلويدات والأنثوسيانينات والفينولات والأنثراكوينون. وثبت أن ظهور المركبات الأيضية الثانوية يكون مصحوبا بتكشف محدود لخلايا نباتات العائلة الباذنجانية Solanaceae خصوصا إذا لم تستبدل البيئة الغذائية ببيئة حديثة التجهيز. فمثلا إذا لم تجدد زراعة الكالس الخاص لنباتي Atropa belladonna Hyoscyamus nigery بعد نهاية أربعة الأسابيع الأولى من الزراعة قد يكون ذلك سببا في تنشيط نمو الجذور والسوق وتكوين نموات تشبه الأجنة خلال الأسابيع الأربعة التالية. وفى المرحلة الأخيرة من طور الثبات العددي للخلايا Late stationary-phase قد تتكون الأجنة وتتكون مركبات Tropane alkaloids مثل Atropine وكثير من مركبات Hyoscyamine و Scopolamine. وتتجمع هذه المركبات في التكوينات الخلوية المتكشفة وقد تتجمع في التجمعات الخلوية البسيطة. وقد تظهر بعض التكشفات الخلوية وبعض الأعضاء النباتية بعد أن تصبح العناصر الغذائية وقد قاربت على النفاذ من البيئة الغذائية. ويتأثر ظهور هذه التكشفات بتمثيل مواد ثانوية مشابهة لما تنتجه النباتات الكاملة. وتعد هذه ظاهرة طبيعية تبين أن سلامة تكوين المواد الأيضية الثانوية مرتبط بسلامة التركيب البنائي للخلايا.
الكثافة الحرجة للخلايا المعلقة
تعرف الكثافة الحرجة للخلايا بأنها أقل كثافة من الخلايا يجب حقنها في البيئة السائلة لكي تبدأ في النمو والانقسام بصورة جيدة. فقد يؤدى زراعة عدد قليل من خلايا الكالس في بيئة سائلة إلى فشلها في استعادة قدرتها على الانقسام، وقد تنمو هذه الخلايا وتنقسم بسرعة إذا زرعت بكثافة أكبر في بيئة غذائية مماثلة. لذلك فإن تقدير الكثافة الحرجة للخلايا في البيئة السائلة عند بدء التجربة له أهمية. وتتهيأ الخلايا سريعا للانقسام عقب زراعتها في البيئة السائلة، ويزداد عددها بتعدد انقسامها حتى ترتفع كثافة الخلايا في المعلق. عندئذ تبدأ سرعة انقسام الخلايا في الانخفاض تدريجيا نتيجة تزاحمها. ويمكن أن يكون واحد أو أكثر من عناصر البيئة الغذائية هو المحدد لهذا الانقسام والوصول إلى مرحلة الثبات العددي للخلايا Stationary phase. وعند هذه المرحلة يستلزم إجراء الزراعة الثانوية Sub-culturing بهدف زيادة عدد الخلايا بما يكفي واحتياج العمل. ويمكن رسم خط بياني يوضح العلاقة بين معدل نمو الخلايا أثناء فترة التحضين ابتداء من فترة ما بعد الزراعة مباشرة حتى الوصول إلى مرحلة ثبات عدد الخلايا ويفضل إجراء الزراعة الثانوية بأخذ عينات من معلق الخلايا قبل وصولها إلى مرحلة الثبات أو عقب وصولها إلى هذه المرحلة مباشرة بدون تأخير للمحافظة على حيوية الخلايا وقدرتها على النمو والتكاثر وتحديد مرحلة الثبات العددي للخلايا يكون وفقا للعدد الأولى للخلايا عند بدء الزراعة وسرعة نموها ويفضل أن يكون التركيز الأولى للخلايا ما بين 0,5 - 2,5 × 510 خلية / سم3 . ويزداد هذا التركيز أثناء فترة الحضانة فيصبح 1 -4 × 610 خلية/ سم3. ويعني ذلك أن 10 خلية / سم. ويعنى ذلك أن جميع الخلايا انقسمت بمعدل 4-6 مرات في فترة 18- 25 يوما. وإذا تم سحب عينة من الخلايا لإعادة زراعتها فإن الفترة اللازمة لبلوغها التركيز المذكور تصل إلى 6 - 9 أيام فقط.
تقدير عدد الخلايا المعلقة
لقياس عدد الخلايا في السنتيمتر المكعب يستلزم إضافة حجم واحد من معلق الخلايا إلى حجمين من محلول 8 % ثالث أكسيد الكروميك Chromium trioxide. ثم ترفع درجة حرارة المحلول إلى 70 م لمدة 2 - 15 دقيقة. وتحدد هذه الفترة الزمنية تبعا لمرحلة نمو الخلايا في البيئة الغذائية. بعدها يترك الخليط ليبرد ثم يهز بقوة لمدة 10 دقائق في جهاز هزاز. ويفضل إضافة البكتين إلى معلق الخلايا للحصول على نتائج أفضل. ويخفف محلول الخلايا بمعدل مناسب لكي تصبح الخلايا سهلة العد والفحص تحت المجهر. ويتطلب الفحص المجهري استخدام شرائح زجاجية تحتوي على ثلاث قنوات يصل عمقها إلى 1200 ميكروميتر حيث يكون هذا العمق مناسبا لمعظم خلايا الأنواع النباتية المختلفة. وتنقل عينة من معلق الخلايا إلى الشريحة وتترك فترة لكي تهدأ الخلايا وتثبت. ويمكن تحديد عددها تحت المجهر بقوة تكبير 100 مرة، ثم يتم حساب عدد الخلايا في قناة واحدة تختار عشوائيا من القنوات الثلاث بالشريحة ويكرر ذلك لخمس شرائح تحتوي على عينات من نفس معلق الخلايا تحت الاختبار ويجب أن تحتوي القناة الواحدة على 5 - 10 خلايا، فإذا كان حجم القناة الواحدة يساوى 0،99 ميكرولتر (µL) فإنه يمكن حساب عدد الخلايا على أساس واحد سنتيمتر مكعب.
توجيه الخلايا المعلقة نحو النمو والتطور
تنشط سلسلة من العمليات الحيوية والفسيولوجية أثناء نمو الخلايا. فتمتص الخلايا حاجتها من البيئة الغذائية وتقوم أيضا بإفراز مواد أيضية. وتتأثر البيئة بكل من ظاهرتي الامتصاص والإفراز. ويتأثر بالتالي سرعة انقسام الخلايا واتجاه نموها. ويمكن توجيه الخلايا إلى النمو والتطور بتغيير المحتوى الغذائي للبيئة. والعلاقة المتوازنة للأكسين والسيتوكاينين في البيئة لها تأثير على تكشف الكالس فزيادة تركيز السيتوكاينين (KIN) بالنسبة للأكسين (IAA) في البيئة الغذائية يؤدى إلى تكشف ونمو الأفرع من الكالس وزيادة تركيز الأكسين بالنسبة للسيتوكاينين يشجع تكوين الجذور والتركيزات غير المتوازنة من السيتوكاينين والأكسين يؤدى إلى اضطراب النمو أي لا يتكشف منه نموات خضرية ولا جذور. وهذه هي القاعدة العامة لعدد كبير من الأنواع النباتية لتوجيه النمو نحو تكوين نموات خضرية أو جذرية، وتختلف الأنواع النباتية في احتياجاتها المثلى للأكسينات والسيتوكاينينات، كذلك المكونات الأخرى للبيئة الغذائية لها أهمية في تحديد مسار النمو. وفي الواقع أن ميكانيكية تأثير منظمات النمو لم تتضح بعد. ويعتمد نشاط الخلايا الناتج عن تواجد منظمات النمو والمكونات الأخرى بالبيئة الغذائية على العمر الفسيولوجي للخلايا المزروعة وأصل النسيج المأخوذ منه الجزء النباتي وطول مدة بقاء الخلايا في المعمل (Skoog and Miller, 1957) .
الاكثر قراءة في الزراعة النسيجية
اخر الاخبار
اخبار العتبة العباسية المقدسة
