زراعة البروتوبلاست Protoplast fusion
حتى عام 1970 كانت الممارسات الوراثية في النباتات مركزة على نقل عوامل وراثية من نبات إلى آخر باستخدام التلقيح والإخصاب وإنتاج بيضة مخصبة Zygote. ويحتوي الزيجوت على كروموسومات نصفها من الأب والنصف الآخر من الأم. والكروموسومات هي الحاملة للجينات المعبرة عن الصفات الوراثية للنبات وتسمى جينات كروموسومية Chromosomal genes ومقرها النواة. ويحمل الكلوروبلاست والميتاكوندريا جينات خاصة بصفات السيتوبلازم وتسمى جينات سيتوبلازمية Cytoplasmic genes موروثة من الأم. ويمكن نقل المادة الوراثية بدمج بروتوبلاست خليتين مهضوم جدارهما بواسطة الإنزيمات. وبعد هضم الجدار الخلوي يكون البروتوبلاست مغلفا بالبلازماليما Plasmalemma. ثم يخرج البروتوبلاست تاركا البلازماليما. وقد يكون البروتوبلاست المندمج خاصا بخليتين من الخلايا الجسمية (ثنائية Diploid) أو خاصًا بخليتين من الخلايا الجنسية (أحادية Haploid) مثل بروتوبلاست حبوب اللقاح. ويعتبر دمج البروتوبلاست من طرق الوراثة الجزيئية Molecular genetic التي تهدف إلى نقل مادة وراثية بعيدا عن استخدام التكاثر الجنسي.
النباتات التي يمكن إكثارها بالبروتوبلاست
يمكن فصل البروتوبلاست من جميع الأنواع النباتية تقريبا، ولكن لا يمكن إكثارها جميعا بالبروتوبلاست. فيمكن إكثار أنواع نباتية كثيرة مثل التبغ والطماطم والبطاطس والفلفل والباذنجان التابعة للعائلة الباذنجانية Solanaceac وبعض الأنواع التابعة للجنس Brassica التابع للعائلة الصليبية Cruciferae وبعض محاصيل العلف Forage التابعة للعائلة البقولية Leguminasae وبعض الأنواع التابعة للعائلة الخيمية Umbelliferae. أما عن العائلة النجيلية Gramineae فيصعب تكاثرها بالبروتوبلاست باستثناء الأرز الذى يمكن اكثاره بالبروتوبلاست وأثبتت بعض التجارب الفردية عدم نجاح تكاثر القمح وقصب السكر والذرة والشعير والراي Rye والتريتيكال Tritical والسورجم Sorghum بالبروتوبلاست بينما توجد بشائر ناجحة في إكثار بعض نباتات الأعلاف البقولية مثل البرسيم الحجازي Alfalfa والبرسيم المصري Clovers والتيفال Trefoils والنباتات البقولية المنتجة للحبوب مثل فول الصويا والبسلة والفاصوليا والترمس وبالرغم من ذلك فإنها تحتاج إلى مزيد من الأبحاث المؤكدة مع الاهتمام بخصوبة النباتات الناتجة.
مراحل إنتاج البروتوبلاست المندمج (الهجين)
1- مرحلة اختيار الجزء النباتي.
2- مرحلة اختيار الإنزيمات الهاضمة لجدر الخلية.
3- مرحلة زراعة الخلايا النباتية.
4- مرحلة فصل البروتوبلاست
5- مرحلة تنقية البروتوبلاست.
6- مرحلة اندماج البروتوبلاست.
7- مرحلة عزل البروتوبلاست المندمج.
8- مرحلة الانتخاب المعملي للطفرات.
9- مرحلة تكوين جدر جديدة لخلايا البروتوبلاست.
10- مرحلة انقسام ونمو خلايا البروتوبلاست.
1- مرحلة اختيار الجزء النباتي
تختلف الأنواع النباتية في استجابتها للتكاثر بالبروتوبلاست، لذلك فإن اختيار النوع النباتي المناسب له أهمية كبيرة في انجاح التجربة. وأن يكون البروتوبلاست المندمج ثابتا وراثيا. وأن تفصل الأجزاء النباتية من نباتات جيدة النمو وخالية من الأمراض ونامية في المعمل أو صوبة محمية. فإذا فصلت الأجزاء النباتية من نباتات نامية خارج المعمل فيستلزم تعقيمها جيدا حتى لا يؤثر رداءة التعقيم على جودة البروتوبلاست.
ويفصل البروتوبلاست من أنسجة نباتية عديدة بصرف النظر عن مرحلة نموها مثل القمم النامية للأفرع والبادرات والفلقات والسويقة الجنينية Hypocotyl والأنسجة الخازنة للدرنات والكورمات والقلقات وغيرها.
وتفضل الأوراق الخضراء حديثة العمر المغطاة بطبقة رقيقة من الكيوتيكل لسهولة هضم الجدر الخلوية بالإنزيمات وتحقيق أعلى عائد من البروتوبلاست. بينما أنسجة الأوراق البالغة تكون ملجننة ويصعب هضمها بالإنزيمات وتعطى عائدا أقل من البروتوبلاست وتعتبر خلايا الميزوفيل Mesophyll في الورقة من المصادر الهامة للبروتوبلاست لقدرتها على التمثيل الضوئي. وتعتبر مزارع الخلايا المعلقة مصدرا هاما للحصول على البروتوبلاست لأنها خلايا نشطة في الانقسام، ولها قدرة عالية للتطور وتكوين جدر خلوية جديدة. وعند فصل البروتوبلاست من الخلايا المعلقة يجب اختيار الخلايا التي تكون في مرحلة نمو واضحة وتكون ذات جدر رقيقة غير مغلظة. ولا يفضل أحيانا استخدام الكالس أو الخلايا المعلقة لعدم ثباتها وراثيا، مع أن التغييرات الوراثية لها أهمية كبيرة عند مربى النباتات واستحداث الطفرات.
2- مرحلة اختيار الإنزيمات الهاضمة لجدر الخلية
يفصل البروتوبلاست باستخدام مجموعة من الإنزيمات الهاضمة للجدر الخلوية. ويمكن التعرف من الدراسات السابقة على الإنزيمات المناسبة لهضم جدر الخلايا لكل نوع من النباتات وتحديد التركيز المناسب لكل إنزيم ومدة المعاملة، وقد يستلزم إجراء تجارب للحصول على هذه المعلومات. ويجب التعرف إلى مكونات الجدار الأولى للخلية، حيث تختلف مكوناته باختلاف نوع الخلية ومصدرها إن كانت من نباتات ذات فلقتين أو ذات فلقة واحدة. ويتركب الجدار الأولى في جميع النباتات أساسا من مواد غروية محبة للماء شاملة البروتين والسليلوز والهيميسلسولوز. وفى خلايا نباتات الفلقتين يكون السليولوز والألياف مغطى بطبقة واحدة من الهيميسليلوز Hemicellulose مرتبطا بالزيلوجلوكان Xyloglucan . ويرتبط الهيميسليلوز والألياف بمواد بكتينية مرتبطة بالزايلوجلوكان بينما في خلايا نباتات الفلقة الواحدة يكون الهيميسليلوز مرتبطا بأرابينوزيلان Arabinoxylan. وعلى ذلك يتطلب استخدام خليط من الإنزيمات يتكون من محلول مركز من Cellulase لتفكيك وتحليل الجدار الأولى للخلية وPectinasc لفصل الخلايا من الطبقة الوسطى للأوراق النباتية وتأثير هذين الإنزيمين في صورتهما الطبيعية أقوى من الإنزيمات الصناعية. وهذا يدل على احتواء الإنزيم الطبيعي الخام على مركبات وإنزيمات أخرى لها أهميتها في تحلل الجدار الأولى. ويستخلص السليوليز من فطر Myrothecium verrucaria وحشرة Trichoderma viride . ويستخلص البكتينيز Pectinase من فطر Rhizopus . ويستخلص معقد إنزيمي من فطر Basidiomycete له القدرة على إذابة الجدار الخلوي لبعض الأنواع النباتية بفاعلية كبيرة. ويقوم إنزيم الهيميسليوليز بإذابة الجدار الخلوي بنجاح ويستخلص خليط من الإنزيمات المحللة للجدر الخلوية من الطحالب ويستخدم عادة خليط من السليوليز لإذابة السليولوز Cellulose والبكتينيز لإذابة البكتين Pectine والهيميسليوليز لإذابة الهيميسليولوز وتحقق بعض الإنزيمات الصناعية نجاحا في ذلك. وبالرغم من ذلك يتميز العديد من الخلايا بأن لها جدرا ثانوية مقاومة لفعل هذه الإنزيمات ويصعب تحليلها إنزيميا ويصعب فصل البروتوبلاست منها. وقد يكون لمعقد الإنزيمات الخام تأثيرات غير مرغوبة على البروتوبلاست المستخلص بفعل الآثار الجانبية للمواد الأخرى الداخلة في تركيبه فقد تسبب هذه الإنزيمات انفجار الخلايا المنتفخة Turgid وخروج البروتوبلاست بسرعة كبيرة مما يؤدى إلى موتها ، خصوصا إذا تعرضت الخلايا المنتفخة للإصابة بمرض العفن الطري Softrot. أما إذا كانت الخلايا متبلزمة فإن البروتوبلاست يبدى مقاومة أكبر لهذه الإنزيمات وتكون سرعة خروجه أقل. لذلك يفضل تعريض الأنسجة النباتية المصابة بالأمراض إلى حالة البلزمة قبل تعريضها للإنزيمات لتقليل الضرر المتوقع على البروتوبلاست. ويجب التخلص من الأملاح الموجودة طبيعيا في مستخلص الإنزيمات، وذلك بوضعه في عمود Biogel P6 Column مقاسه 2,5-40 سم ثم يغسل العمود بإضافة 5 ملليلتر من الماء حتى تفصل الأملاح تدريجيا من المستخلص . ثم تجمع الجزيئات المتبقية مع بعضها وتجفف بالتجميد Freeze dry ، وتضاعف هذه الطريقة فاعلية الإنزيم في فصل البروتوبلاست بسرعة. وقد ثبت نجاح هذه الإنزيمات في فصل البروتوبلاست من الخلايا المعلقة.
3- مرحلة زراعة الخلايا النباتية
يفضل زراعة الخلايا في بيئة سائلة لاستخلاص البروتوبلاست منها وإمكان التحكم في مكونات البيئة الغذائية والبيئة المحيطة أثناء التحضين. كما تساعد البيئة السائلة على ترشيد استهلاك الإنزيمات الهاضمة وتوفير قدر كبير منها وتساعد على تفكك الأنسجة وزيادة عدد الخلايا المنفردة في البيئة بسبب انتشار الإنزيمات بين الخلايا وإذابة الجدر الخلوية وتحرير البروتوبلاست منها بسهولة والبروتوبلاست الناتج من البيئة السائلة يتأقلم بسرعة للزراعة المعملية ولا يحتاج إلى تعقيم. وقد تتعرض الخلايا للبلزمة أثناء فصل البروتوبلاست وتحدث لها أضرار شديدة. لذلك توضع الخلايا المفككة في محلول منظم للضغط الأسموزي، ثم يضاف المحلول المنظم المحتوى على الخلايا إلى محلول الإنزيمات لضمان استقرار البروتوبلاست وعدم انفجاره، ويجب تحديد التركيز المناسب من المحلول المنظم ومتابعة أثره على سلامة البروتوبلاست أثناء خروجه من الخلية والحصول على أكبر كمية منه. ويستخدم الجلوكوز والسكروز والمانيتول والسوربيتول كمركبات لضبط الأسموزية عند 700 - 800 ملليموز. وتسبب المعاملة الخطأ انخفاض حيوية البروتوبلاست .
4- مرحلة فصل البروتوبلاست
خطوات فصل البروتوبلاست
1- تزرع الأجزاء النباتية المعقمة في دوارق سعة 250 ملليلتر تحتوي كل منها على 90 ملليلتر بيئة سائلة للحصول على كالس وتجدد زراعة الكالس في بيئة سائلة طازجة ثلاثة مرات بين كل فترة وأخرى 4 أيام، للحصول على كمية كبيرة من البروتوبلاست والتأخير في استخلاص البروتوبلاست يقلل كميته.
2- تثبت الدوارة على جهاز هزاز يعمل بسرعة 124 دورة / دقيقة لمدة 10 - 14 يوما ، بعدها تقسم البيئة بكل دورق على ثلاثة دوارة جديدة بمعدل 30 مللي/ دورة . ويضاف بيئة سائلة طازجة ليصل حجمها 90 مللي / دورق. ثم ترفع الدوارق من الهزاز وتترك لترسب الخلايا إلى القاع. ويتم التخلص من الجزء العلوي من البيئة السائلة. ثم ينقل الجزء السفلى المحتوى على الخلايا المترسبة إلى دورق آخر سعة 100 ملليلتر.
3- يضاف إلى معلق الخلايا خليط من إنزيمات معقمة بواسطة مرشحات تعقيم، ويحتوي الخليط على 3% Driselase + 0.05 % (PATL) Pectic Acid Transe Liminase + 13 % مانيتول + أملاح CPW . وتضبط الحموضة عند 5.6 pH ويضاف خليط الإنزيمات بمعدل 20 ملليلتر / دورق. ويفضل أن تتم المعاملة الإنزيمية بسرعة، ثم تحضن عادة في ظلام عند 27 م بعد تثبيت الدوارق على هزاز يعمل بسرعة 72 دورة / دقيقة لمدة 2 - 2,5 ساعة.
4- يضاف إلى خليط الإنزيمات 25 ملليلتر من محلول يحتوي على 13% مانيتول وأملاح CPW.
5- ينقل المحلول المحتوى على خلايا وبروتوبلاست إلى أنابيب اختبار تحتوى على غطاء محكم الغلق وتثبت على جهاز طرد مركزي يعمل بسرعة 100 دورة/ دقيقة ولمدة 5 دقائق ثم يستبعد الجزء العلوي من البيئة الغذائية ويضاف بدلا منه حجم صغير من محلول يحتوي على 13٪ مانيتول + أملاح CPW.
6- يمرر المحلول بأكمله خلال منخل من النايلون الخشن للتخلص من البقايا الكبيرة من حطام الخلايا، ثم يمرر مرة ثانية خلال منخل نايلون ناعم (0,64 ميكروميتر) للتخلص من البقايا الأصغر حجما، ثم يحمل الراشح المحتوى على خلايا وبروتوبلاست على جهاز طرد مركزي يعمل بسرعة 100 دورة / دقيقة لمدة 5 دقائق، ثم يستبعد الجزء الطافي.
7- يضاف إلى الخلايا والبروتوبلاست محلول يتكون من 21% سكروز + أملاح CPW ويعاد تحميل الدوارق على جهاز طرد مركزي يعمل بسرعة 100 دورة / دقيقة لمدة 5 دقائق لتجميع البروتوبلاست في الجزء العلوي من السائل بينما تهبط الخلايا وحطامها إلى القاع. ويسحب البروتوبلاست بماصة باستير وينقل إلى بيئة غذائية، ويؤخذ جزء بسيط من المخلوط للفحص وتحديد كمية البروتوبلاست المفصول.
وبهذه الطريقة يمكن فصل 2,5 × 610 خلية بروتوبلاست بكل دورق سعة 250 ملليلتر وبزراعة البروتوبلاست بتركيز (2٫5 × 410 ملليلتر في بيئة سائلة تحتوي على أملاح العناصر الغذائية + 2 ملليجرام / لتر NAA تركيز + 0,5 ملليجرام / لتر BAP + 9 % مانيتول يبدأ البروتوبلاست في النمو بكفاءة عالية .
مكونات أملاح (CPW) :
- فوسفات بوتاسيوم ثنائي الإيدروجين KH2PO3 بتركيز 27٫2 ملليجرام / لتر.
- نترات بوتاسيوم KNO3 بتركيز 101 ملليجرام / لتر.
- كلوريد كالسيوم CaCl2.2H2O بتركيز 1480 ملليجرام / لتر.
- يوديد بوتاسيوم KI بتركيز 0,16 ملليجرام / لتر.
- سلفات ماغنسيوم MgSO47H2O بتركيز 246 ملليجرام / لتر.
- سلفات نحاس CuSO4.5H2O بتركيز 0,025 ملليجرام / لتر.
( أ ) استخدام خليط الإنزيمات لفصل بروتوبلاست من أوراق نبات التبغ
1- تزرع بذور التبغ في ظلام تام وحرارة 21م لإنتاج بادرات. ثم تنقل البادرات إلى صوبة زجاجية تحت ظروف إضاءة شدتها 9000 لكس لمدة 16 ساعة يوميا وحرارة 25 - 28 م. تنقل النباتات إلى إصص قطر 12 سم تحت إضاءة 11 ألف لكس، وتروى النباتات بالنشع من أسفل الأصيص.
2- تجمع الأوراق كاملة التمدد بعد 60 يوما من الإنبات. ثم تعقم الأم الأسطح الخارجية للأوراق بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم التجاري، ثم تغسل عدة مرات بماء معقم لإزالة الآثار المتبقية من مادة التعقيم ثم تترك الأوراق حتى تذبل ويترهل قوامها، ثم تزال وتستبعد بشرتها السفلى، ثم تقطع الأوراق إلى أجزاء صغيرة وتفرد في أطباق بترى 14سم ، ويضاف إلى الأجزاء الورقية محلول مانيتول بتركيز 13 % يحتوى على أملاح (CPW) بعد ضبط حموضته عند 5.8 pH باستخدام حمض هيدروكلوريك تركيز ه عياري.
3- يسحب محلول المانيتول وأملاح (CPW) من أسفل الأوراق المجزأة بعد 1 - 2 ساعة، ويوضع بدلا منها 20 ملليلتر من خليط إنزيمات معقمة بمرشحات التعقيم
يشمل 4 % Maccrozyme + 13 % Mannitol + 4% Meicolase + أملاح CPW وتضبط الحموضة عند 5.8pH ثم يحضن الخليط والأوراق المجزأة لمدة 8 ساعات عند 27م وظلام تام مع تحريك الأوراق بملقط لتسهيل خروج البروتوبلاست. ثم يترك البروتوبلاست في نفس الظروف لمدة 30 دقيقة، ثم تستبعد الإنزيمات بماصة باستير Pasteur pipette .
4- ينقل البروتوبلاست إلى أنبوبة اختبار لها غطاء محكم ويضاف إليه محلول المانيتول وأملاح CPW. ثم تثبت الأنابيب على جهاز طرد مركزي يعمل بسرعة 35 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، ثم تستبدل البيئة بمحلول 20٪ مانيتول وأملاح CPW. ثم تثبت الأنابيب مرة ثانية على جهاز الطرد المركزي يعمل بسرعة 50 دورة/ الدقيقة ولمدة 10 دقائق، يطفو بعدها البروتوبلاست على السطح حيث يسحب بماصة باستير. ثم يضاف إليه 10 ملليلتر بعد فصله من محلول المانيتول وأملاح CPW وتؤخذ منها عينات للفحص ويلاحظ أن حطام الخلايا تستقر في قاع الأنابيب حيث تستبعد بعد رفعها من جهاز الطرد المركزي.
(ب) استخدام تعاقب الإنزيمات لفصل بروتوبلاست من أوراق نبات التبغ
تستخدم هذه الطريقة في دراسة الفيروسات التي تصيب أوراق نبات التبغ. وتتلخص في اختيار نباتات عمر 60 - 70 يوما نامية في أصص عند 22 - 25 م وشدة إضاءة 10 - 11 ألف لكس، وفترة إضاءة 16 ساعة يوميا من مصابيح فلوروسنت بيضاء. ويفصل البروتوبلاست من أوراق غير مكتملة الانبساط بطول 20 - 25 سم، تقع بين الورقة السادسة والتاسعة من قمة النبات. وتتلخص هذه الطريقة فيما يلي: تعقم الأوراق ثم تغسل بالماء المقطر المعقم للتخلص من بقايا مواد التعقيم، ثم تستبعد البشرة السفلية.
تقطع الأوراق منزوعة البشرة السفلية إلى قطع وتوضع في 20 ملليلتر من محلول معقم بفلتر تعقيم يحتوي على 13 % Mannitol + 9 % Macerozyme + 1 % Potassium dextransuphate، وتضبط حموضته عند pH5.8 باستخدام حمض هيدركلوريك تركيز 2 عياري، ويساعد هذا المحلول على ذبول الأجزاء الورقية. ثم يحمل المحلول المحتوى على الأوراق المجزأة على جهاز هزاز يعمل بسرعة 100- 120 دورة/ الدقيقة عند جرارة 25 م.
تجمع الخلايا المفصولة من الأجزاء الورقية منزوعة البشرة على مراحل بعد 30، 75، 120 ، 180 دقيقة من بدء عمل الهزاز، على أن تستبدل البيئة الغذائية بعد كل فترة زمنية ببيئة مماثلة طازجة. مع ملاحظة أن المرحلتين الأخيرتين من تجميع الخلايا محتوية على خلايا برانشيمية.
توضع الخلايا في جهاز طرد مركزي سرعته 100 - 200 دورة الدقيقة لمدة 2-3 دقيقة، ثم تغسل مرتين بمحلول ماتيتول حديث التحضير بتركيز 13% ويعاد وضعها في جهاز الطرد المركزي.
بعد الخطوات السابقة توضع الخلايا المفصولة في 40 ملليلتر من إنزيم Cellulase الخام بتركيز 4% مضاف إليه 13% مانيتول، وتضبط الحموضة عند 5.8 pH باستخدام حمض هيدروكلوريك تركيز 2 عياري قبل التعقيم بمرشحات التعقيم. ثم تحضن الخلايا المعلقة عند 36 م لمدة 3-3,5 ساعة مع مراعاة وجود قضيب يتحرك بصورة محورية لمنع تكتل وتجمع الخلايا خلال فترة إزالة الجدار الخلوي.
بعد انتهاء الفترة الزمنية المحددة تنقل الخلايا مع البيئة الغذائية إلى جهاز طرد مركزي مرة ثانية يعمل بسرعة 100 دورة / الدقيقة ولمدة دقيقة واحدة تغسل بعدها مرتين بمحلول المانيتول تركيز 13 % مضاف إليه كلوريد الكالسيوم تركيز 0.1 % ملليمولر. ويعاد تثبيتها مرة ثانية على جهاز طرد مركزي كما في المرة السابقة، بعد ذلك يتم فصل البروتوبلاست باستخدام 5 ملليلتر من المانيتول.
(جـ) فصل بروتوبلاست من أنسجة غير ورقية
يفضل فصل البروتوبلاست من أنسجة ورقية ولا يفضل استخلاصه من أنسجة أخرى. وقد يرجع ذلك إلى صعوبة تحديد التركيب الإنزيمي المناسب لفصل البروتوبلاست من هذه الأنسجة وصعوبة تغلغل الإنزيمات بين الخلايا ويمكن فصل البروتوبلاست من الخلايا البرانشيمية وغيرها باستخدام نفس الإنزيمات المذكورة سابقا إذا كان لها جدار خلوي رقيق. ويستلزم استخدام كميات كبيرة من إنزيم Pectinase عند فصل البروتوبلاست من الثمار المحتوية على نسبة عالية من البكتين. ويمكن الحصول على البروتوبلاست من حبوب اللقاح باستخدام إنزيم Helicase المحضر بطريقة التجفيف بالتجميد حيث يتميز باحتوائه على إنزيم B 1-3 glucanase ذي القدرة العالية على هضم مادة الكالوس Callose الموجودة في الجدار الخلوي، ووجود ترسيبات كبيرة من مادة Sporopollinin على جدر حبوب اللقاح يكون سببا لإعاقة استخلاص البروتوبلاست منها بواسطة الإنزيمات.
5- مرحلة تنقية البروتوبلاست
بعد الحصول على البروتوبلاست، يرشح خلال مناخل 33 - 100 ميكروميتر من الصلب أو النيلون للتخلص من بقايا جدر الخلايا وغيرها. ثم يحمل الراشح على جهاز طرد مركزي يعمل بسرعة منخفضة مع التكرار بعد إضافة محلول 21٪ سكروز، حيث إن الطرد المركزي السريع يحدث أضرارا شديدة للبروتوبلاست لرقته. ثم يجمع البروتوبلاست المتكتل على السطح ويراعى أن وجود منظمات نمو مختلفة في البيئة تسبب تغييرا في عملية البناء الضوئي للبروتوبلاست، ومنع تكوين جدر خلوية جديدة ونمو الخلايا. وقد يتغير شكل البروتوبلاست ويصبح غير كروي ويستمر ذلك لمدة طويلة. فإذا توفرت الظروف المناسبة تنقسم خلايا البروتوبلاست، وقد يكون الانقسام في المرحلة الأولى مضطربا غير متناظر أو شاذ، وربما يرجع ذلك إلى فقد مواقع المعلومات بالخلية Information positions نتيجة تدهور شبكة البلازمودزماتا Plasmodesmata. وبذلك يتدهور الاتصال بين الخلايا ويتغير النظام الهيكلي للخلية Cytoskeleton pattern ويحدث تغيير في نظام الإمداد بالعناصر وفي حجم ومساحة أسطح الخلايا، ويتوقف التيار السيتوبلازمي Cytoplasmic stream لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد فصل النسيج.
أسباب انخفاض محصول البروتوبلاست من الخلايا
بالرغم من توفر الظروف المثلى فإن أكبر كمية مستخلصة من البروتوبلاست حوالي 30 %، وأسباب ذلك :
1- مقاومة جدر الخلايا إلى فعل إنزيم Cellulase. ولذلك يمكن استخدام أنواع مختلفة من الإنزيمات مثل Maccrozyme R10; Onosuka R10; Driselase. ويعتبر أفضل تركيز لإنزيم Cellulase R10 هو 1 %، وأفضل تركيز لإنزيم Macerozyme R10
هو 0٫2٪.
2- سرعة موت خلايا عديدة بعد نقلها من بيئة غذائية إلى بيئة أخرى عند رفع الضغط الأسموزي للخلايا من أجل تحرير البروتوبلاست من الجدر الخارجية للخلايا. وقد يستخدم السكروز بدلا من المانيتول بهدف زيادة الضغط الأسموزي، بالرغم من أن السكروز يؤدى إلى خفض كمية البروتوبلاست المستخلصة بصورة واضحة جدا.
3- تتأثر كمية البروتوبلاست المستخلصة من الخلايا المعلقة والأنسجة النباتية بمرحلة النمو. وتعتبر مرحلة الانقسام السريع للخلايا المعلقة في البيئة الغذائية هي أفضل المراحل بالمقارنة بمرحلة الثبات العددي للخلايا، وثبت أن هذه الفترة كانت بعد 4 - 5 أيام من الزراعة المعملية لنبات التبغ.
6- مرحلة اندماج البروتوبلاست Protoplast fusion
خاصية اندماج البروتوبلاست
يتميز البروتوبلاست بقدرته على الاندماج الذاتي والتكتل، ويمكن الاستفادة من هذه الخاصية في دمج بروتوبلاست خلايا جسمية نباتية وإنتاج خلايا هجينية منها. وتختلف سرعة الاندماج والتكتل باختلاف النوع النباتي. فقد يندمج البروتوبلاست بعد فصله مباشرة إذا تعرض لبعض العوامل الطبيعية. وقد يحتاج بعض الوقت حتى يندمج. وقد تنخفض قدرته على الاندماج والتكتل تدريجيا بمرور الفترة الزمنية عقب فصله. لذلك يفضل تحديد الفترة الحرجة لكل نوع نباتي وهي الفترة الزمنية التي يقضيها البروتوبلاست المفصول قبل اندماجه ويؤدى الفصل البطيء للبروتوبلاست إلى حدوث اندماج بين خلايا النسيج الواحد، وهو ما يسمى بالاندماج الذاتي للخلايا Spontaneous fusion ، ويحدث الاندماج الذاتي أثناء هضم الجدار الخلوي باستخدام الإنزيمات. حيث تبدأ الخيوط البلازميدية Plasmodesmata التي تربط الخلايا ببعضها بالتمدد والزيادة في الحجم والانتشار في مساحة أكبر مما يسمح بانتقال محتويات خلية إلى خلية أخرى مجاورة لها. وعلى هذا الأساس فإن ظاهرة الاندماج الذاتي تعتمد على صفات الأنسجة النباتية ودرجة تعقيدها. ولا يكفي وجود التقارب بين البروتوبلاست لحدوث الاندماج بل يتطلب أيضا أن تكون الشبكة البلازميدية متقاربة وعلى بعد أقل من واحد ملليمتر. والبروتوبلاست المفصول من خلايا معلقة يكون غنيا بالسيتوبلازم ويكون أكثر قابلية على الاندماج بالمقارنة بالبروتوبلاست المفصول من الطبقة الوسطى للورقة، وقد يرجع ذلك إلى أن بروتوبلاست الطبقة الوسطى للورقة يحتوي على طبقة رقيقة من السيتوبلازم حول الفجوة العصارية كبيرة الحجم بجانب وجود جسيمات أخرى مثل الكلوروبلاست وبالفحص المجهري تظهر بعض التغييرات في البروتوبلاست عقب فصله مباشرة مثل وجود بروتوبلاست يحتوى على نواتين Nucleus ، وقد يرجع ذلك إلى أن الخلية أثناء فصل البروتوبلاست كانت في مرحلة انقسام أو في أطوارها النهائية من الانقسام.
أهداف اندماج البروتوبلاست
بإزالة جدر الخلايا يصبح البروتوبلاست عاريا وقابلا للتداول العديد من الممارسات المعملية والوراثية مثل:
1- اندماج مجموعتين كاملتين من المجموعات الكروموسومية Genomes وإنتاج هجين منهما.
2- نقل جزء من المجموعة الجينية من بروتوبلاست واهب إلى بروتوبلاست مستقبل لإنتاج هجن غير متناظرة جزئيا Partial asymmetric.
3- نقل جسيمات Organells (يسمى هجين سيتوبلازمی Cybrid) مثل الكلوروبلاست والميتوكوندريا بهدف نقل صفة معينة مثل مقاومة المبيدات أو مقاومة الحشائش أو نقل صفة العقم الذكرى السيتوبلازمي.
طرق دمج البروتوبلاست (تهجين البروتوبلاست)
1- الاندماج باستخدام مركبات كيميائية Chemically induced fusion
لتشجيع اندماج البروتوبلاست، يجب أن تكون الأغشية البلازمية Plasma mem branes في تلامس تام ونظرا لوجود شحنة سالبة على سطح البروتوبلاست تعمل على حدوث تنافر بين البروتوبلاست المتجاور، لذلك يجب التخلص من الشحنات السالبة لمنع التنافر بين البروتوبلاست المتجاور ويتم الاندماج بسهولة. وتستخدم وسائل عديدة تعمل على تغيير الشحنات السالبة، منها تغيير الحموضة (pH) أو إضافة كاتيونات متعددة Polycations أو نزع الماء Dehydration من البروتوبلاست وقد وجد أن تعريض بروتوبلاست الطبقة الوسطى للورقة إلى بيئة تميل إلى القلوية - تحتوي على أيونات كالسيوم - يؤدى إلى تكوين أعداد كبيرة من البروتوبلاست المندمج وكانت أفضل النتائج عندما تعرض البروتوبلاست إلى محلول منظم Buffer solution (pH (10.5 والتحضين عند 37 م ولمدة 10 - 15 دقيقة. ويجب ألا تطول مدة التعريض عن 45 دقيقة حتى لا يؤدى إلى تكوين بروتوبلاست غير ثابت وغير متماسك واستخدمت هذه الطريقة بنجاح في إحداث الاندماج والتهجين في خلايا جسمية لنبات البيتونيا.
ويعتبر مركب (Polyethylene glycol (PEG (الوزن الجزيئي 1500-6000 دالتون) من أكثر المركبات استخداما في الاندماج الكيميائي للبروتوبلاست. وإضافة هذا المركب بجرعات متتالية إلى معلق البروتوبلاست يؤدى إلى تجمعه Agglutination بنسبة 1 - 10 %، ثم يتبع ذلك التخلص من هذا المركب بإضافة محلول منظم حموضته (11-9 pH) يحتوي على نسبة مرتفعة نسبيا من أيونات الكالسيوم (10 - 15 ملليمولر). وميكانيكية هذا الاندماج قد تكون ناتجة عن حدوث انتشار جانبي للبروتينات الملاصقة للأغشية وخلق مناطق غنية في الليبيدات غير مستقرة تؤدى إلى الاندماج وقد لا تؤدى طرق الاندماج الكيميائي إلى النتيجة المتوقعة وقد يرجع ذلك إلى أن بروتوبلاست بعض الأنواع النباتية لا يتحمل التعرض للمركب (PEG). كذلك يختلف تأثير هذه المادة في التخلص من الشحنات السالبة الموجودة على سطح البروتوبلاست باختلاف وزنها الجزيئي وتركيزها وكثافة البروتوبلاست في البيئة الغذائية ودرجة حرارة التحضين وكثافة الشحنات الموجبة المضافة للبيئة. وقد ثبت أن مادة (PEG) ذات الوزن الجزيئي 1540 هي الأفضل من استخدام أوزان جزيئية أقل أو أعلى من ذلك، وتستخدم بتركيز لا يقل عن 31% وتحضن عند 35 م ثم 15 م. كذلك ثبت نجاح طريقة تكتل بروتوبلاست الجزر وثلاثة أنواع من التبغ وهم ;stocktonii; N. tabacum N, nesophila . باستخدام الفصل الإنزيمي ثم تعريض البروتوبلاست المفصول لجهاز مميز الخلايا Cell Storter - Flow Cytometer" عند طول موجة 514 نانوميتر وإشعاع ضوئي مرئي مقداره «400mW » باستخدام فلاتر 510 LP 590; FT 560; BG 38; LP مما يؤدى إلى تحفيز الاندماج بنسبة كبيرة. ويستخدم الدكستران Dextran بنجاح مع بروتوبلاست نباتات ; Petunia hybrida Brassica pekinensis; Nicotiana tabacum لدمجها مع بروتوبلاست الجزر، ويتم ذلك في الخطوات الآتية:
- يستخلص بروتوبلاست النباتات الثلاثة المذكورة وكذلك بروتوبلاست نبات الجزر كل على حدة.
- يخلط 10 ملليلتر من بروتوبلاست الجزر مع مقدار مساو له من أي من البروتوبلاست الثلاثة، ثم يكرر ذلك مع بروتوبلاست الأثنين الآخرين، ثم يوضع كل خليط منهم في محلول 0,55 مولر مانيتول.
- ينقل 0,4 ملليلتر من بيئة الاندماج (متكونة من 15% دکستران Dextran + واحد مولر كلوريد صوديوم لكل طبق بترى بلاستيك يحتوي على 0٫2 ملليلتر بروتوبلاست. ثم يضاف لكل طبق بترى 0,4 ملليلتر من بيئة الاندماج مرة ثانية ثم تحضن الأطباق عند 30 م لمدة 15 دقيقة، بعدها يضاف 0.2 ملليلتر كلوريد صوديوم تركيز 1,36 مولر، وبعد مرور 15 دقيقة أخرى يتم تخفيف المحلول بإضافة 5 ملليلتر بيئة غذائية مضافا إليها مانيتول تركيز 0٫27 مولر ومواد أخرى غير عضوية بتركيز 13 مولر. ثم يحضن الخليط عندهم لمدة ساعة واحدة فقط، بعدها تنقل إلى الغرفة العادية. وبعد 24 ساعة يجمع البروتوبلاست ويفحص.
2- الاندماج الكهربائي Electrofusion
( أ ) المرحلة الأولى
يوضع البروتوبلاست في بيئة غذائية منخفضة التوصيل الكهربائي بين قطبين كهربائيين Two electrodes وتردد مرتفع بين القطبين (0.5-1.5Mhz ). وبواسطة فصل كهربائي ثنائية Dielectrophoresis على جهاز الكتروفوريسيس تصبح الشحنة على سطح البروتوبلاست مستقطبة وكأنها ثنائية القطبين Dipoles. وأثناء هجرة البروتوبلاست على طول خطوط المجال الكهربائي تتلامس مع بعضها وتكوين ما يسمى سلاسل اللؤلؤ Pearl chains موازية لخطوط المجالات الكهربائية المستخدمة. ويتوقف طول السلاسل على كثافة البروتوبلاست وقوة المجال الكهربائي وطول مدة تطبيق المجال الكهربائي ويفضل استخدام مجالات كهربائية متجانسة Uniform fields بين الإلكترودات Electrodes بينهما مسافات حوالي 5 ملليمتر حيث تهاجر خلايا البروتوبلاست نحو هذه الإلكترودات، وتتكون عليها سلاسل مركزة من البروتوبلاسنت غير مشتتة إلى إلكترودات أخرى وبكميات كبيرة بحيث يسهل ملاحظتها والتعامل معها وتستخدم عادة خمسة إلكترودات متوازية مصنوعة من الصلب غير قابل للصدأ مثبتة في وعاء من البرسبكس Perspex حجمه 5 ملليلتر. ومن الممكن أن تندمج 0,5 - 1 × 610 بروتوبلاست في الدورة الواحدة 0,5 التي تستغرق 60 - 90 ثانية. ومن الممكن أيضا استخدام بدائل للإلكترودات وخلايا كهربائية مغايرة للتصميم المذكور. وقد وجد أن النسبة الكلية المندمجة تصل إلى 60 % في خليط مكون من عشيرتين من البروتوبلاست بنسبة 1 : 1. ولوحظ أن 50 % من هذه النسبة يحدث بها اندماج بنسبة 1 : 1 داخلي بين خلايا عشيرة واحدة متماثلة و 50٪ يحدث اندماج بين خلايا العشيرتين مكونة خلايا هجينية خليطة النواة Heterokaryons .
(ب) المرحلة الثانية
تعريض سلاسل البروتوبلاست إلى نبضات كهربائية مباشرة بجهد (1-13-kVcm) وقصيرة ما بين 10 - 200 ميكروثانية كافية لإحداث ثقوب Electro poration في الغشاء المحيط بالبروتوبلاست والأغشية التي في تماس مع بعضها وبذلك يسهل دمج البروتوبلاست. ومن الممكن إدخال DNA وجسيمات أخرى إلى البروتوبلاست مباشرة. ويستخدم جهاز إطلاق النبضات الكهربائية Capacitor discharge spike” pulses لدمج البروتوبلاست. وتتميز طريقة الاندماج الكهربائي للبروتوبلاست بتفوقها على الطريقة الكيميائية. وأن البروتوبلاست المتلاصق في سلاسل هو المستهدف. كما يمكن توليد ومضات ذات جهد كهربائي مختلف، ويمكن عد البروتوبلاست المندمج.
العوامل المؤثرة في اندماج البروتوبلاست
- مصدر البروتوبلاست، إن اندماج البروتوبلاست المفصول من أوراق النوع البري للبطاطس Solanum brevidens أسرع من اندماج البروتوبلاست المفصول من معلق خلايا نفس النوع المؤقلم للزراعة التقليدية.
- الومضات الطويلة للجهد الكهربائي (الفولت) الأعلى تحقق اندماجا أكثر.
- البروتوبلاست كبير الحجم أسرع في الاندماج من صغير الحجم. وسلاسل البروتوبلاست الأطول تعطى اندماجا متكررا أكثر من السلاسل القصيرة. لذلك يعامل البروتوبلاست الأصغر حجما مسبقا بمادة Spermine لكي يعمل على زيادة مساحة أغشية البروتوبلاست المتماسة وتجمعه في سلاسل.
- يعمل كلوريد الكالسيوم على زيادة نسبة الاندماج بإزالة الشحنات السالبة على أسطح البروتوبلاست، بينما مادة نترات الصوديوم المستخدمة أحيانا في إزالة الشحنات السالبة تحقق نتائج أقل كثيرا. لذلك يفضل احتواء بيئة الاندماج Fusion medium على مانيتول Manitol + واحد ملليمولر كلوريد كالسيوم CaCl2. وبهذه المعاملة يرتفع نسبة اندماج البروتوبلاست من 30٪ إلى 60٪.
- يحدث الدمج عادة بالتحضين في تركيز مرتفع من مركب (PEG) وتركيز مرتفع من أيونات الكالسيوم (Ca++) ورقم حموضة مرتفع نسبيا (يميل إلى القلوية). وهذه المعاملة ضرورية لإزالة الشحنات السالبة الموجودة على البروتوبلاست. على أن يتم التخلص من آثار المخلوط (PEG) و (++Ca) بالغسيل بعد إتمام الاندماج والمتوقع نجاحا عظيما لطريقة الدمج الكهربائي، حيث تؤدى إلى الحصول على كثير من البروتوبلاست الحي أكثر من استخدام مركب (PEG). كما حقق دمجا للبروتوبلاست باستخدام مركب Dextran ومنشط كهربائي .
7- مرحلة عزل البروتوبلاست المندمج
Selection of somatic hybrid cells
* عزل مباشر تحت ميكروسكوب Direct isolation
تشفط الخلية الهجينية المندمجة بماصة ميكرومترية Micropipett أو بأنبوبة شعرية Micro capillary متصلة بسرنجة Syringe لها قلاووظ محكم. وتشفط الخلايا ذات الأنوية المندمجة Heterokaryons واحدة بعد الأخرى تحت ميكوسكوب ضوئي. وبالرؤية المباشرة يمكن بسهولة تمييز البروتوبلاست الهجين من بين بروتوبلاست الأوراق وبروتوبلاست الخلايا المعلقة.
* الرؤى بالعين Visual method
أحيانا يمكن تمييز الخلايا الهجينية ذات الأنوية المندمجة بالعين المجردة إذا كانت متميزة بصفة معينة عن غيرها في اللون وحجم البروتوبلاست. فمثلا يمكن تمييز الخلايا الهجينية الخالية من الكلوروفيل بسهولة إذا كانت ناتجة من اندماج خلايا لا تحتوي على كلوروفيل أو تمييزها بوجود خيوط سيتوبلازمية وكلوربلاست إذا اندمج سيتوبلازم خلية تحتوي على كلوروفيل وسيتوبلازم لا يحتوي على كلوروفيل.
* استخدام جهاز مميز الخلايا Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)
ويسمى أيضا Continuous flow cytometer. وتعتمد هذه الطريقة على تلوين بروتوبلاست خلايا النوعين المطلوب دمجهما كل بلون خاص مختلف عن الآخر. وتستخدم صبغات وميضية Fluorescent dyes مختلفة (تسمى دلائل وميضية Fluoescence markers مثل Fluorescein أو Rhodamine. وباستخدام جهاز مميز الخلايا Cell Sorter يمكن تمييز وانتخاب وفصل الخلايا ذات النواة الهجينية ذات الألوان المختلفة وذلك بتمرير خلايا البروتوبلاست المندمجة وغير المندمجة في جهاز مميز الخلايا حيث تمتص الخلايا الهجينية الطاقة الضوئية ثم تنبعث منها في صورة وميض ضوئي مختلف.
الطرق الطبيعية للفصل Separation on physical characteristics
حققت الطرق الطبيعية تقدما كبيرا في تمييز الخلايا الهجينية . حيث تستخدم طريقة التمييز بين الشحنة الكهربائية المنتشرة على سطح الخلايا الهجينية ومقارنتها بالشحنة المنتشرة على بروتوبلاست الآباء واختلاف تأثير الطرد المركزي على الخلايا الهجينية بالمقارنة بالآباء وهي طرق يمكن أن تؤدى إلى نتائج جيدة في حالة الكثافة العالية من الخلايا الهجينية في البيئة الغذائية ولكن يجب عدم الاعتماد عليها بصورة مطلقة.
8- مرحلة الانتخاب المعملي للطفرات من الهجن الجسمية
قد تحدث طفرات ذاتية في الهجن الجسمية الناتجة من اندماج بروتوبلاست خليتين من خلايا الصنف النباتي النامي في البيئة الغذائية أو تحدث في هجن جسمية ناتجة من اندماج بروتوبلاست مستخلص من خليتين مختلفتين في الصنف أو النوع أو الجنس أو العائلة. ويمكن استحداث طفرات في الخلايا الجسمية المندمجة بتعريضها لبعض المطفرات مثل Ethylmethane sulphonate Nethyl nitro-ureum أو أشعة جاما أو أشعة إكس أو بنقل جينات أو إحداث تغيير في تركيب الحمض النووي DNA، وعند انتخاب طفرات من الهجن الجسمية للبروتوبلاست يتم التركيز على الخلايا الهجينية ذات الصفات غير العادية. ويفضل الإبقاء على الخلايا غير المعاملة بالمطفرات للمقارنة مع الخلايا المعاملة مع الاهتمام بمتابعة كل خلية منتخبة بمفردها من حيث التكاثر والتكشف والنمو للحصول على سلالة خلوية Cell line .
طرق الانتخاب المعملي للطفرات
(أ) الانتخاب المباشر للطفرات
تنتخب الطفرات من المزارع المعملية للبروتوبلاست أو من معلق الخلايا التي تتميز بالقدرة على النمو تحت ظروف غير عادية من الإجهاد البيئي مثل الملوحة والجفاف والمضادات الحيوية والسموم النباتية Phytotoxins والعناصر الثقيلة وغيرها.
(ب) طرق تحليلية لصفات الهجن الجسمية Characterization of somatic hybrids
1- تحليل مشابه الإنزيم Isoenzyme analysis
يتم تحليل الآباء الداخلة في التهجين وتحليل الهجين الناتج نفسه باستخدام جهاز الإلكتروفريزيس حيث تظهر حزم مختلفة من البروتين على الجيل Gel . ويظهر للهجين تعبير جيني عن بعض الحزم مشابها في ذلك أحد الأبوين وربما تظهر حزم إضافية مشتقة من تركيبات جديدة ناتجة من وحدات إنزيمية فرعية. ومن مشابهات الإنزيم المستعملة كدلائل ;Glucose - 6 - phosphate dehydrogenase Phosphoglucose isomerase; Glutamine oxaloacetate transaminase; Esterase and shikimate dehydrogenase
2- تحليل جزيء "دنا" بالنواة Nuclear DNA analysis
يستخلص الحمض النووي DNA من الكروموسومات أو من الكلوروبلاست أو الميتوكوندريا ثم يجزأ إلى شظايا Fragments باستخدام إنزيمات قطع Restriction enzymes ثم ترقم إحدى الشظايا بالفوسفور المشع (32P) وتلصق بجزيء DNA آخر، فسوف يظهر في الهجن الناتجة طرز مختلفة لحزم هجينية Hybridization bands من DNA يمكن متابعتها باستخدام الأوتوراديوجرام Autoradiograms.
3- النشاط الإنزيمى Enzyme activity
إذا استخدمت طفرتان تتميزان بخاصية نقص إنزيم Nitrate reductase deficient (NR-) خاص باختزال النترات، أي إنهما لا يستطيعان الاستفادة من النترات كمصدر للنيتروجين. فإن الهجن الناتجة منهما قد تختلفان عن الآباء وتكون لها القدرة على الاستفادة من النترات كمصدر للنيتروجين لاحتوائها على إنزيم Nitrate reductase وفى هذه الحالة يمكن تقدير نشاط الإنزيم.
4- المظهر الخارجي Morphology
قد يظهر على الهجن الجسمية صفات ظاهرية محددة أو ظهور بعض الصبغات مثل الأنثوسيانين Anthocyanin أو وجود شعيرات على سطح الورقة. وقد تكون بعض هذه الصفات موروثة من الأب أو الأم. وقد تظهر صفات جديدة في الهجن غير موجودة أصلا في الآباء مثل ظهور صبغة قرمزية اللون على السطح الخارجي من درنات البطاطس الهجن وظهور لون أصفر أو أحمر في لحم الدرنة.
5- تحليل سيتولوجي Cytological analysis
يمكن تقدير تكامل الكروموسومات للهجن الجسمية بطريقة روتينية بواسطة الضغط بشدة على قمة الجذر واستخلاص الكروموسومات من كلا الأبوين وتبين التحاليل الهجن التي تملك التكامل المتوقع للكروموسومات القادمة من كلا الأبوين، كما يمكن تمييز الانقسامات الشاذة Aneuploidy.
6- تحليل الصفات المرغوبة Analysis of desired characters
تقدر الصفات الزراعية المرغوبة مثل مقاومة الأمراض والصفات القياسية المعروفة لدى مربى النباتات.
9- مرحلة تكوين جدر جديدة للبروتوبلاست المندمج
تكوين الجدار الخلوي للبروتوبلاست المندمج من المراحل الهامة في زراعة البروتوبلاست. حيث يرتبط انقسام الخلية ونموها بتكوين الجدار الخلوي للبروتوبلاست. وتبدأ مرحلة نشوء الجدار الخلوي الجديد بعد نقل البروتوبلاست إلى بيئة خالية من الإنزيمات المحللة للسليلوز. فبعد 16 ساعة من نقل بروتوبلاست التبغ في بيئة غذائية يزداد تكوين لويفات سليولوزية على السطح الخارجي من البروتوبلاست. وبعد يومين تتكون جدر خلوية جديدة لحوالي 60 - 80 ٪ من البروتوبلاست. وبعد ثلاثة أيام من الزراعة تتكون جدر خلوية لجميع البروتوبلاست وأثناء هذه المرحلة يستلزم المحافظة على الضغط الأسموزي للبروتوبلاست في البيئة الغذائية عند الحد الأمثل يتناسب مع زراعة ونمو البروتوبلاست حتى لا تحدث أي تغييرات غير مرغوبة في بناء خلية البروتوبلاست . لذلك يجب أن يكون تركيز أيونات الكالسيوم (++Ca) مرتفعة والجهد الأسموزي السالب للبيئة منخفضا خلال إعادة تكوين الجدار الجديد حول البروتوبلاست ، ثم يرفع الجهد الأسموزي للبيئة تدريجيا خلال الأيام القليلة من بدء تكوين الجدار الخلوي. ويحدث أول انقسام للخلية الجديدة بعد 2 - 7 أيام من زراعة البروتوبلاست وتتحول الزراعة في هذه المرحلة من زراعة بروتوبلاست إلى زراعة خلايا نباتية عادية. لذلك تحفز الخلايا الجديدة على الانقسام والنمو والتكشف إلى أعضاء نباتية مختلفة حتى يتم تكوين النبات الكامل. وتستخدم مادة Calcaflour White ST بتركيز 0٫1٪ للكشف عن تكوين الجدار الخلوي الجديد ويتميز هذا المركب بقدرته على انعكاس الضوء الساقط عليه من مصدر للضوء الأزرق. ويعامل البروتوبلاست بهذا المركب سواء كان في بيئة سائلة أو صلبة. حيث توضع الخلايا المتكونة حديثا لمدة 5 دقائق مع مراعاة الحفاظ على الضغط الأسموزي وغسل الخلايا بعد ذلك لإزالة المتبقي من هذه المادة. وتفحص تحت الضوء الأزرق. فالخلايا التي كونت جدارا يكون لها القدرة على انعكاس الضوء الأزرق. ويفي بهذا الغرض مصباح زئبقي يحتوي على فلتر إنارة 12 BG وفلتر مكثف 510 K. ولوحظ أن البروتوبلاست المستخلص من الطبقة الوسطى لأوراق التبغ استعادت نشاطها وكونت جدارا خلوية بسرعة، وأن حوالي 60 - 80 ٪ من هذه الخلايا بدأت في الانقسام بعد 4 أيام من زراعتها في البيئة الغذائية. ويؤدى انقسام هذه الخلايا إلى تكوين كتل من الكالس. ويضاف لبن جوز الهند إلى البيئة الغذائية للحصول على انقسام خلوي جيد والحصول على كتل من الكالس، ويمكن تحفيز خلايا الكالس على النمو وتكوين أفرع والحصول على نباتات كاملة.
10- مرحلة انقسام ونمو خلايا البروتوبلاست المندمج
العوامل المؤثرة في انقسام ونمو خلايا البروتوبلاست
1- العوامل الوراثية
تنمو بعض أنواع البروتوبلاست بصورة جيدة على بيئة غذائية معينة دون غيرها من البيئات بالرغم من ثبات الظروف البيئية المحيطة ، وقد يرجع ذلك إلى أسباب وراثية، حيث تختلف كفاءة انقسام البروتوبلاست باختلاف الأنواع التابعة للجنس بيتونيا Petunia ، ويصعب انقسام البروتوبلاست المستخلص من النوع P. paradii بصرف النظر عن نوع البيئة المستخدمة، بينما البروتوبلاست المستخلص من النوع P.hybrida أو من نباتات الجيل الأول للهجين P. paradii x P. hybrida . كان سهل الانقسام. كذلك يتأثر نمو البروتوبلاست بمستوى تضاعف العدد الكروموسومي بالخلية. فمثلا قابلية انقسام البروتوبلاست المستخلص من نباتات ثنائية كان مرتفعا بالمقارنة مع بروتوبلاست النباتات الأحادية. ويحتاج البروتوبلاست المستخلص من خلايا الطبقة الوسطى لأوراق نباتات أحادية إلى إضافة معقدات طبيعية إلى البيئة لتشجيعه على الانقسام.
2- نوع النبات
تختلف كفاءة نمو خلايا البروتوبلاست في البيئة الغذائية باختلاف الأنواع والأجناس النباتية. فقد نجح 38 جنسا نباتيا من بين 66 جنسا في إنتاج نباتات من خلايا البروتوبلاست، وأن بروتوبلاست نبات الأرز هو الأسهل من بين الأجناس التابعة للعائلة النجيلية Gramineae. كذلك ينجح إكثار أجناس تابعة للعائلة Solanacea مثل ;Capsicum; Datura; Browallia; Lycopersicon; Solanum; Nicotiana ، Atropa; Petunia; Hyocyamus وأنواع نباتية تابعة لعائلات نباتية مختلفة مثل Daucus carrota; Medicago sativa; Brassica napus; Asparagus officinalis; Mani- hot esculenta Trifolium repens; sinesis Citrus . ولم تصل الأنواع التابعة للجنس Nicotiana إلى مستوى كفاءة النوع Nicotiana tabacum من حيث قابليته للانقسام والنمو. وكان النوع N. sylvestris أقل كفاءة في الانقسام ونمو البروتوبلاست بالرغم من محاولات تحسين الظروف البيئية المحيطة وتغيير مكونات البيئة. ويعتبر القمح والشعير وغيرهما من محاصيل الحبوب بأنها ضعيفة في إعطاء بروتوبلاست قادر على الانقسام والنمو حتى ولو كان مستخلصا من الطبقة الوسطى للورقة لصعوبة تكوين الجدار الخلوي للبروتوبلاست وعدم القدرة على الانقسام وصعوبة الحصول على كالس من أوراق هذه المحاصيل.
3- البيئة الغذائية
أثناء فصل البروتوبلاست قد يحدث ضرر للشبكة البلازميدية مما يؤدى إلى تسرب بعض مكوناته من السوائل إلى البيئة الغذائية، لذلك تضاف بعض منظمات النمو ومواد أخرى إلى البيئة لتعويض ما تفقده. كما أن هز الدوارق المحتوية على بروتوبلاست بجهاز الرج قد يؤدى إلى تمزق الشبكة البلازميدية وتحطيم البروتوبلاست. لذلك يفضل أن يكون البروتوبلاست في بيئة سائلة ساكنة أو متحركة ببطء للمحافظة على البلازميدات ومساعدة البروتوبلاست على الهبوط بسلام إلى قاع الدورة وثبت أن إضافة 6 مللي بيئة سائلة حاملة للبروتوبلاست فوق بيئة مماثلة مضاف إليها آجار (بيئة ثنائية المظهر) Two-phases medium في طبق بترى قطر 9 سم أعطت نتائج جيدة واستخدام الأطباق الزجاجية أفضل من البلاستيكية لتجنب التصاق البروتوبلاست على جدر الأطباق البلاستيكية.
ويفضل إضافة 0,04-0,02٪ مادة ناشرة مثل 80 -Tween لمنع الالتصاق. وتستخدم هذه الطريقة بنجاح كبير في زراعة البروتوبلاست. ومن فوائد هذه الطريقة إمكان استبدال البيئة السائلة (الطبقة العلوية في الطبق البتري) ببيئة أخرى مماثلة لنفس البيئة السائلة ولكنها طازجة ويمكن أيضا إحلال أجزاء من البيئة الصلبة (الطبقة السفلية في الطبق البتري) بأجزاء من بيئة مماثلة صلبة طازجة وبنفس الحجم. ويتم هذا الاستبدال في البيئة السائلة والصلبة باستمرار للمحافظة على الضغط الأسموزي وتحفيز الخلايا على النمو والانقسام بصورة منتظمة. وبهذه الطريقة تنشأ تجمعات من خلايا البروتوبلاست وتهبط على طبقة البيئة الصلبة في قاع الطبق وتنمو بنجاح، ويمكن متابعتها ونقلها فيما بعد للإكثار. وتستخدم بنجاح البيئات الجاهزة التي لها نفس مواصفات بيئة (MS) لزراعة البروتوبلاست وثبت أن إضافة كلوريد الكالسيوم بتركيز 5 ملليمولر وكبريتات الماغنسيوم بتركيز 4 ملليمولر للبيئة كان لها القدرة على الحفاظ على الأغشية البلازمية والحصول على نتائج جيدة في زراعة البروتوبلاست المفصول من خلايا الطبقة الوسطى للأوراق.
ويمكن زراعة البروتوبلاست في بيئة سائلة أو صلبة، بالرغم من أن لكل منهما بعض المشاكل. ويفضل أن تحتوي البيئة الصلبة على 0٫2 % آجار بدلا من 0,6%، ويفضل النوع Baker Agar بدلا من Difco Agar وإضافة الكازين -Casein hydro lysate أو بعض الأحماض الأمينية مثل الجلوتامين إلى البيئة تعطى نتائج جيدة. ويعتبر السكروز هو المفضل دائما كمصدر للطاقة والكربون، وإضافة الجلوكوز أو الزايلوز Xylose والرايبوز Ribose مجتمعة أو منفردة إلى البيئة تعطى نتائج مفيدة. وإضافة الأكسينات (-D; NAA2.4) والسيتوكاينينات (BAP ;KIN) منفردة أو مجتمعة بتركيز 0.1 - 5 ملليجرام / لتر إلى البيئة لها أهمية كبيرة جدا لاستمرار نمو خلايا البروتوبلاست وتحقيق انتظام وجودة النمو ويختلف تركيز منظمات النمو في البيئة باختلاف البروتوبلاست ومصدره. أما بالنسبة للمواد الحافظة على الضغط الأسموزي فتستخدم نفس المواد المستخدمة في مرحلة فصل البروتوبلاست. ويعتبر المانيتول بتركيز 0.5 - 0,6 مولر أكثرها استخداما. ويستخدم كذلك خليط المانيتول + السربيتول بنجاح أيضا. كما يستخدم سكر الجلوكوز مع بروتوبلاست خلايا نبات الفول البلدي وفول الصويا. بينما كان السكروز مفضلا لنمو بروتوبلاست نبات Brome grass .
4- الظروف البيئية المحيطة
تختلف أنواع البروتوبلاست في احتياجها للحرارة أثناء التحضين، لذلك يجب تحديد درجة الحرارة المناسبة حتى لا تكون سببا رئيسيا في تثبيط نمو البروتوبلاست فمثلا يحضن بروتوبلاست نبات التبغ عند 16 - 37°م وبروتوبلاس نبات الطماطم عند 29 م لكي يحقق كفاءة عالية في النمو والانقسام. وللضوء تأثير كبير في إنجاح البروتوبلاست خاصة إذا كان مصدره الطبقة الوسطى للأوراق. وتعتبر أفضل شدة إضاءة لبروتوبلاست نبات التبغ هي 3300 لكس، وانخفاض شدة الضوء يؤدى إلى انخفاض قدرة البروتوبلاست على النمو.
5- كثافة البروتوبلاست في البيئة الغذائية
كثافة خلايا البروتوبلاست في البيئة السائلة لها أهمية كبيرة في طبيعة نموها وتشير الدلائل إلى إمكانية نمو بعض أنواع البروتوبلاست عند كثافة منخفضة جدا تصل إلى 1000 بروتوبلاست / ملليلتر بيئة ويفشل بروتوبلاست نبات التبغ في الانقسام والنمو إذا كانت كثافته أعلى من 5 × 10 بروتوبلاست/ ملليلتر بيئة، وأن الكثافة المثلى التي أعطت أفضل معدل للانقسام والنمو هي 5 × 410 بروتوبلاست/ ملليلتر بيئة، ولم يلاحظ أي انقسام عندما كانت كثافة البروتوبلاست 6 × 310 بروتوبلاست / ملليلتر بيئة أو أقل من ذلك. ومن ناحية أخرى وجد أن أفضل كثافة لبروتوبلاست خلايا نبات البيتونيا Petunia هي 3٫5 × 10 4 / ملليلتر.
أهم الممارسات الوراثية للبروتوبلاست المندمج
1- التهجين الجسمي بين أنواع مختلفة Somatic hybridization
يعرف التهجين الجسمي أيضا باسم Para-sexual hybridization. في الواقع أن دمج البروتوبلاست ليس له ميزة خاصة لإنتاج هجن جسمية في حالة إذا كان من السهل إنجاز التهجين بالطرق التقليدية. ودمج البروتوبلاست له أهمية كبيرة في إنتاج خلايا هجينية لبعض المحاصيل التي يصعب تهجينها بالطرق التقليدية لأسباب عدة مثل عدم وجود قرابة أو عدم توافق أو وجود عقم ذكرى أو مسببات أخرى. فإذا اندمج اثنان من البروتوبلاست من نفس النوع النباتي تتكون نواة متجانسة Homokaryon . وإذا اندمج اثنان من البروتوبلاست واندمجت نواتاهما وهما مختلفان في الجنس أو النوع تتكون نواة غير متجانسة Heterokaryon. وفي كلتا الحالتين تندمج النواتان بعد اندماج البروتوبلاست ثم يتكون جدار خلوي حول البروتوبلاست لتتكون خلية جديدة وبزراعة خلية البروتوبلاست على بيئة غذائية وظروف بيئية مناسبة تنقسم ويتكون منها نبات كامل. وبالرغم من صعوبة التهجين في الحقل بالطرق التقليدية بين نوعين من البطاطس أحدهما S.tuberosum (يكون درنات وغير مقاوم أو قليل المقاومة للأمراض) والثاني S.brevidens (لا يكون درنات ومقاوم للأمراض)، فقد نجح التهجين بينهما بدمج البروتوبلاست والحصول على نباتات كاملة من الخلية الهجينية. كذلك تم إنتاج هجينين أحدهما تابع للجنس Brassica وهو ( Brassica oleracea x B. compestris » والآخر تابع للجنس Medi cago وهو «Medicago sativa x M. falcate» بدمج البروتوبلاست وكان هناك صعوبة في إنتاج الهجينين بالطرقة التقليدية. وتم الحصول أيضا على الهجين Nicotiana langsdorffii x N. glauca بدمج البروتوبلاست وثبت أن الحالات التي ينجح فيها التهجين بين جنسين وإنتاج بذور منهما بالطرق التقليدية هما أيضا قادران على إنتاج هجن بطريقة الدمج بين البروتوبلاست لذلك يجب اختيار مستعمرات من البروتوبلاست نجح فيها الاندماج وتكوين هجن على أن يتوفر التوافق بينهما وتندمج جميع محتويات النواتين في نواة هجينية لأن كثيرا ما يؤدى الاندماج بين البروتوبلاست إلى فشل الأنوية في الاندماج أو فقد بعض الكروموسومات نتيجة لعدم قدرتها على الحركة السريعة واللحاق بمرحلة التناسخ Replication ، وبناء على ذلك يمكن أن تفقد أعدادا كبيرة من الخلايا نتيجة بطئها الشديد في النمو وعدم قدرتها على الانقسام وبعد إتمام اندماج البروتوبلاست تظهر صعوبة في انتخاب الهجن الجسمية Somatic hybrids من مجموعة الخلايا الموجودة. فمثلا إذا حدث تهجين بين بروتوبلاست خليتين مختلفتي المصدر (A) و (B) فإن عشيرة الخلايا الهجينية الناتجة قد تحتوى بعضها على بروتوبلاست غير مندمج من (A) ومن (B) بجانب بروتوبلاست مندمج مكونا هجينا ذات نواة متجانسة (Homokaryons ((AA و (BB). وقد تندمج النواتان مكونة نواة هجينية غير متجانسة (AB) Heterokaryons بجانب أنواع مختلفة متعددة الأنوية ومندمجة. وقد حدث تطور في طرق انتخاب الهجين المرغوب (AB) . ونجح التهجين الجسمي بين أنواع نباتية كثيرة مثل :
Brassica campestris; B. oleraceae; B. napus: Medicago sativa; Petunia spp., Lycopersicon lycopersicum; Solanum tuberosum; Daucus carota, Nico- tiana species; Pennisetum americanum; Trifolium repens.
كذلك نجح التهجين الجسمي بين أجناس نباتية مختلفة مثل :
“Solanum tuberosum x Lycopersicon lycopersicum"
"Brassica x Arabidopsis"
"Daucus carota x Acgopodium podagraria"
2- إنتاج هجن سيتوبلازمية (Cytoplasmic hybrids (Cybrids
هي طريقة مازالت في مراحلها الأولى لانخفاض نسبة نجاحها حيث يتم التهجين بدمج بروتوبلاست (نواة + سيتوبلازم) لنبات (A) مع سيتوبلازم فقط من نبات (B). وقد نجحت هذه الطريقة في إنتاج هجين سيتوبلازمي-N. plumbaginifolia x Nicotiana tabacum وهذا النوع من التهجين هام في حالة وجود ظاهرة عقم ذكري سیتوبلازمي Cytoplasmic male sterility تتحكم فيه جينات محمولة على الميتوكوندريا أو مقاومة بعض الأمراض أو مقاومة لبعض مبيدات الحشائش.
3- زراعة الأنوية Transplantation of nuclei
تنحصر في امتصاص نواة خلية ثم زراعتها في خلية أخرى، أو فصل قطعة من الحمض النووي DNA عليها جين خاص بصفة محددة مثل مقاومة مرض معين، ثم إدخالها على جينوم نبات آخر. وتسمى هذه الطريقة بتهجين الحمض النووي. كذلك تشمل هذه الفكرة على فصل جسيمات مثل البلاستيدات والميتوكوندريا من سيتوبلازم خلية ما ونقلها إلى سيتوبلازم خلية أخرى. وهذه طريقة واعدة من طرق الهندسة الوراثية.
4- إنتاج نباتات ثنائية ورباعية
يتم ذلك بدمج بروتوبلاست خليتين ثنائية العدد الكروموسومي لإنتاج خلية رباعية .Tetraploid أو دمج بروتوبلاست خليتين أحاديتين Haploids للحصول على نباتات ثنائية Diploids ، ثم معاملة النباتات الثنائية بالكولشسين لإنتاج نباتات رباعية.
5- التحور الوراثي Transformation
قد يؤدى دمج البروتوبلاست إلى تكامل جيني وظهور صفة في الهجين الناتج غير موجودة في الآباء مثل طفرتين من نبات التبغ Nicotiana tabacum- الأولى حساسة للضوء (SS vv) والثانية أقل حساسية (ssVV) والتهجين بينهما أنتج هجينا ( SSss VVvv) غير حساس للضوء وهى صفة غير متوفرة في الآباء. كذلك وجد أن كلا من نياتي B. langsdorfi, Nicotiana glauca. يحتاج إلى إضافة أكسين النمو إلى البيئة الغذائية، وبدمج البروتوبلاست بينهما أنتج هجينا يتميز بالاكتفاء الذاتي من الأكسين المنتج طبيعيا في خلاياه.
سلبيات التهجين الجسمي Disadvantages of somatic hybridization
لاحظ (1983 ,Sneep, et al., 1982; Harms) وجود بعض السلبيات للتهجين الجسمي منها :
1- لا توجد طريقة ذات كفاءة عالية للانتخاب والمنتج النهائي للتهجين الجسمي غالبا يكون عقيما أو متغيرا في صفاته الخارجية أو غير ثابت وراثيا أو ميتا خصوصا في حالة اندماج سيتوبلازم لأبوين غير متقاربين.
2- نمو كايميرا بالكالس Chimeric calluses في موقع الخلية الهجين نتيجة لعدم اندماج نواتي الخليتين بالرغم من اندماج البروتوبلاست.
3- يؤدى التهجين الجسمي بين خليتين ثنائية العدد الكروموسومي إلى تكوين خلايا ملتصقة Amphidiploid وليست مندمجة، وهي ظاهرة غير مستحبة.
4- يظهر في الأجيال التالية للتهجين الجسمي بين أنواع متباعدة في المملكة النباتية بعض الشذوذ مثل غياب كروموسوم أو حدوث انقسامات شاذة Aneuploids أو غياب نواة من السيتوبلازم Cybrids.
إنتاج بروتوبلاست أحادي Haploid Protoplast
يتشابه بروتوبلاست خلايا طبقة الميزوفيل المفصول من نباتات أحادية برتوبلاست النباتات الثنائية من حيث الانقسام في البيئة الغذائية وإعطاء نباتات قادرة على التكاثر. كذلك يمكن فصل البروتوبلاسست من جميع أجزاء النبات تقريبا ، وأصبح الآن من الأعمال الروتينية بصرف النظر عن إن كان مصدره نباتات أحادية أو متضاعفة العدد الكروموسومى. وقد تميل خلايا البروتوبلاست الأحادي إلى التضاعف الكروموسومى بعد زراعتها في المعمل، ولكن النباتات الناتجة من بروتوبلاست التبغ والبيتونيا والبطاطس والأتروبا والداتورا تحتفظ بثباتها الوراثي وتظل أحادية العدد الكروموسومي. وقد ثبت أن زراعة بروتوبلاست خلايا الميزوفيل هي طريقة واعدة لإكثار النباتات الأحادية.
1- فصل البروتوبلاست من حبوب لقاح ناضجة
في النباتات المزهرة Angiosperms القشرة الخارجية Exine لحبة اللقاح الناضجة مغطاة بمادة Sporopollenin معقد من بوليميرات كاروتينية وإستر كاروتينات في سلسلة مستقيمة غير متفرعة من مركبβ-1,3 Glucan . وهي من أكثر المركبات العضوية صلابة ومقاومة لفعل المذيبات. ويمكن إذابتها فقط في ايدروكسيد بوتاسيوم KOH ومحاليل مؤكسدة قوية وبعض القواعد العضوية الخاصة وبعض الكائنات الدقيقة، ولكن لم يثبت إمكان هضمها بالإنزيمات. ويتم فصل البروتوبلاست من حبوب لقاح ناضجة بإضعاف ثقب حبة اللقاح Germpore وإحداث تحلل جزئي للقشرة الخارجية Exine لحبة اللقاح وإزالة القشرة بعد ذلك ميكانيكيا. ويستخلص البروتوبلاست الأولى Subpro-toplasts من أنبوبة حبة لقاح نابتة. ويتميز البروتوبلاست المفصول حديثا بشكله الكروى pherical واحتوائه على فجوة Vacuole. فإذا عرضت عشيرة من البروتوبلاست للطرد المركزي يندمج بطريقة ذاتية ويكون بروتوبلاست عملاقا متعدد الأنوية Multinucleate giant protoplasts. وبزراعة البروتوبلاست معمليا يحدث له استطالة ثم انقسام وتكوين براعم قادرة على النمو (1975 Bajaj).
2- فصل البروتوبلاست من حبوب لقاح غير ناضجة
نظرا لصعوبة فصل البروتوبلاست من حبوب اللقاح الناضجة فإنه يفضل استخلاصه من خلايا أمية لحبوب اللقاح Pollen mother cells وهي في مرحلة مبكرة من النمو ويفضل أن تكون في مرحلة الانقسام الرباعي Pollen tetrads ، حيث تكون مغلفة بجدار بسيط غير معقد مثل القشرة الخارجية Exine لحبة اللقاح الناضجة. وخطوات فصل وزراعة البروتوبلاست من خلايا أمية لحبوب اللقاح وهي في الطور الرباعي Tetrad قد حددها كالآتي:
1- يفصل متك واحد تحت ظروف معقمة من برعم زهري حديث ثم يصبغ بصبغة Aceto carmine للتأكد من مرحلة نمو حبوب اللقاح.
2- تقطع نهاية قاعدة المتك بواسطة مشرط مدبب الطرف. ثم يضغط على المتك ضغطا خفيفا لإفراز محتواه إلى الخارج باستخدام ملعقة زجاجية Spatula مع مراعاة أن الضغط الشديد نسبيا يؤدى إلى إخراج الخلايا ثنائية العدد الكروموسومي Diploid من المتك في صورة شريطية Tapetal cells. وتظهر محتوى الخلايا الأمية لحبوب اللقاح والخلايا الرباعية Tetrads في صورة محلول لبني.
3- يعامل البروتوبلاست المستخلص بخليط من إنزيم هليكيز Helicase تركيز 0,75-1 % مضافا إليه 8 - 10 % سكروز (إنزيم هليكيز مستخلص من أمعاء قواقع Snail intestines)، وتحضن لمدة 30-45 دقيقة. ويستخدم خليط الإنزيم بمعدل واحد ملليلتر لكل متك واحد فقط .
4- بعد التحضين يتم إحلال خليط الأنزيم بمحلول 10% سكروز ويترك حتى يستقر البروتوبلاست.
5- يشطف البروتوبلاست عدة مرات ببيئة سائلة طازجة، ثم يضاف البروتوبلاست إلى بيئة سائلة ، ثم يزرع في المعمل، فتتكون جدر لبعض البروتوبلاست وتظهر عليه براعم وقد يحدث انقسام أحيانا. وعادة تكون كمية البروتوبلاست المستخلص قليلة. لذلك لا يفضل إجراء الطرد المركزي حتى لا تنخفض كميته. وتلقى زراعة بروتوبلاست حبوب اللقاح قبولا فاترا لقلة ما ينتجه من نباتات أحادية.
الاكثر قراءة في الزراعة النسيجية
اخر الاخبار
اخبار العتبة العباسية المقدسة
