تشخيص فايروسات النبات بدراسة خواص الاحماض النووية الفايروسية بتقانة التهجين

اعتمدت طرق التشخيص والتصنيف الحديثة الدقيقة لفايروسات النبات على معرفة نوع الحامض النووي الفايروسي هل هو النوع الرايبي أو النوع الرايبي منقوص الأكسجين، مفرد أم مزدوج الخيط، ذو قطعة جينومية واحدة Monopartite genome أو عدة قطع جينومية Multipartite genome وكذلك قياس الوزن الجزيئي للجينوم الفايروسي حيث استعملت هذه الطرق بعد التوصل إلى إمكانية تخليق نسخ من الدنا cDNA لأجزاء من الجينوم الرايبي RNA الفايروسي أو لكل الجينوم، وتتم معرفة نوعي الحامض النووي الرنا أو الدنا بواسطة الترحيل الكهربائي حيث يتم فصل الحامض النووي نقيا عن البروتين الفايروسي ثم تمريره في الهلام لغرض تشخيصه من خلال نمط انتشار الحزم والمقارنة مع أحماض نووية قياسية معروفة الوزن الجزيئي ويتم إظهار هذه الحزم بصبغها بصبغة بروميد الايثيديوم Ethidium bromide، أو التعرف عليها بتقانة "التهجين" Hybridization، ويمكن استخلاص هذه الحزم من الهلام وتعليمها إشعاعيا واستعمالها بشكل مسابر نشطة إشعاعيا Radioactive probes ثم الكشف عنها بواسطة طريقة البصم البقعي Dot-blot، وتعد هذه الطريقة مفيدة في الكشف عن الفايروسات في الإصابات الخليطة وفي تشخيص فايروسات أشجار الغابات والفاكهة بسبب صعوبة نقلها ميكانيكيا، كما طورت طريقة التعدد الشكلي التطابقي لنسخ الرنا مزدوج الخيطين المتغايرين" Heterologous duplexes of RNA transcripts polymorphisms والتي استعملت لدراسة الحامض النووي لبعض الفايروسات ذات الجينوم ssRNA والتي تعتمد مبدأ استنساخ نسخ مطابقة للحامض النووي الفايروسي المفرد وجعله مزدوجا مكونا من خيطين متغايرين تتباين سرعة حركتهما في الهلام أثناء الترحيل الكهربي واستعملت هذه الطريقة للكشف عن سلالات فايروسي الاصفرار التماوتي لعروق البنجر (BNYVV) والتبقع الحلقي التموتي للأجاص (PNRSV)، علما بأنها طريقة مطورة أساسا من الطريقة التهجينية المسماة "التعدد الشكلي التطابقي للحامض النووي مفرد الخيط"Single-stranded Conformation polymorphism , SSCP  والمستعملة لتشخيص الفايروسات ذات الجينوم ssDNA.

كما تم أيضا دراسة النمط الانشطاري للجينوم Cleavage patterns of genome بعمل نسخ الدنا cDNA للجينومات الفايروسية الرايبية والرايبية منقوصة الأكسجين ثم شطر نسخة الدنا هذه باستعمال الإنزيمات القاطعة Restriction enzymes ثم تحديد حجوم القطع الناتجة وتشخيصها بواسطة الترحيل الكهربي بهلام البولي أكريل أمايد وهي الطريقة التي استعملت للتمييز بين سلالات فايروس موزائيك القرنابيط (CaMV)، وقد أطلق على هذه الطريقة التهجينية لاحقا مصطلح "خارطة التعدد الشكلي مقيد الطول" Restriction length polymorphism mapping , RFLP والتي استعملت بشكل محدود مع بعض فايروسات Geminiviruses، وتتم كل هذه الدراسات المذكورة أعلاه باستعمال التقانتين أدناه.

1. تهجين الحامض النووي مفرد الخيط

يقصد بتهجين الحامض النووي مفرد الخيط Nucleic acid hybridization إنشاء جزيئة مزدوجة الخيط من جزيئة الحامض النووي مفرد الخيط اعتمادا على حقيقة الارتباط الثابت بين قاعدتي الأدينين والثايمين وقاعدتي السايتوسين والكوانين وهو الأساس الذي بنيت عليه تقانة التهجين الجزيئي Molecular hybridization والتي تستعمل مع كل الفايروسات سواء كانت مفردة أو مزدوجة الخيط حيث يتم التهجين مباشرة مع الفايروسات ذات الجينوم مفرد الخيط.

2. تهجين الحامض النووي مزدوج الخيط

تمر عملية التهجين بخطوتين أساسيتين هما:

1) تفكيك ازدواجية الجينوم

يتم تفكيك ازدواجية الجينوم (انصهار الحامض النووي) Melting or denaturation بفك ارتباط خيطي الحامض النووي بواسطة عملية الدنترة بتعريض الحامض المزدوج إلى درجة حرارة 70-80م فينفصل الخيطين بسبب تفكيك الأواصر الهيدروجينية الرابطة للخيطين، وتسمى درجة الحرارة التي تفصل 50% من ازدواج الخيطين درجة انصهار الحامض النووي" Melting temperature, Tm واهم العوامل المؤثرة عليها هي تركيب الحامض النووي وتركيز محلوله وقيمة أسه الهيدروجيني ووجود المركبات المحطمة للأواصر الهيدروجينية ومنها المركب الفورمامايد" Formamide، ووجد أن درجة انصهار الجينوم dsRNA هي أعلى بكثير من مثيلتها للجينوم dsDNA حيث بلغت للأول بحدود 100م فيما كانت بحدود 85م للثاني عندما كانا مذابين في محلول السترات المنظم. تستعمل المعادلة التالية لحساب درجة انصهار الدنا المثالي الازدواج مذاب في محلول سترات الصوديوم الملحي Saline Sodium citrate

درجة الانصهار= 0,41 X % لقاعدتي الجوانين والسايتوسين في الحامض + 69,3.

ويلاحظ أن هذه المعادلة أغفلت دور القاعدتين الثايمين والأدينين لقلة تأثيرهما على درجة الانصهار لأنهما ترتبطان باصرتين هيدروجينيتين فيما ترتبط قاعدتي الكوانين والسايتوسين بثلاثة أواصر لذا فهي الأكثر تأثيرا على درجة الانصهار.

يمكن فك ارتباط خيطي الحامض أيضا برفع درجة الأس الهيدروجيني لمحلوله فوق قيمة 9 حيث يتفكك الخيطين تماما عند قيمة 12 علما بان قيم الأس الهيدروجيني بين 5-9 لا تؤثر على درجة الانصهار حيث يبقى الحامض المزدوج ثابتا بين هاتين القيمتين.

2) إعادة ارتباط خيطي الحامض النووي المزدوج

يعاد ارتباط خيطي الحامض النووي بالعملية التي تسمى Renaturation أو Association والتي يتم فيها إعادة تركيب الازدواج القواعدي أي التهجين Hybridization وذلك بعد فك ارتباط الخيطين في الخطوة السابقة ووجد أن عملية إعادة الارتباط تتأثر بعاملين هما (1) ثباتيه ناتج إعادة الارتباط التي تتأثر بدورها بكافة العوامل المؤثرة على عملية الدنترة (2) سرعة إعادة الارتباط والتي تتأثر بدورها بعامل الحرارة إذ يعاد الارتباط عادة عند درجة تقل بمقدار 25 درجة مئوية عن درجة انصهار الحامض النووي المختبر وتتأثر أيضا بتركيز الحامض النووي في المحلول حيث يتناسب الوقت اللازم لتكوين المزدوجات Duplexes طرديا مع تركيز الخيوط الفردية النووية المتفاعلة والتي يمكن زيادة تركيزها بإضافة بولمرات مثل مركب "كبريتات الدكستران" Dextran Sulphate بوزن جزيئي 500 ألف دالتون وهو بولمر غير أيوني يسرع من إعادة الارتباط حيث أن زيادته في المحلول بنسبة 10% تزيد من سرعة التهجين بمقدار مائة ضعف (3) قوة الازدواج Stringency وهي القوة الرابطة بين خيطي الحامض النووي المتكاملين بعد التهجين وعلى أساس تكاملية هذا التطابق ومعرفة نسبة عدم التطابق يتم تحديد درجة التماثل بين الخيطين وبالتالي درجة قرابة الفايروس المختبر.

لقد كان الحافز لابتكار هذه التقانة أساسا هو لغرض تشخيص الفايرويدات وذلك لعدم امتلاكها للبروتينات التركيبية وبالتالي عدم وجود مصول مضادة لها لتشخيصها مصليا.

3. أنواع التهجين

تعتمد معظم طرق التهجين المستعملة في التشخيص على طريقة "التهجين ذات الطور الخليط" Mixed-phase hybridization باستعمال "هدف غير متحرك مثبت على طور صلب Immobilized target on Solid الا انه طورت لاحقا طريقة "التهجين المحاليلية" Liquid- Liquid hybridization.

1- طريقة التهجين ذات الطور الخليط phase hybridization

يطلق عليها أيضا "التهجين بالطور الصلب" Solid phase hybridization وهي الطريقة الأكثر شيوعا والتي تستعمل فيها أغشية النايتروسيليلوز أو النايلون والأخير هو موجب الشحنة لذا فهو ذو قوة ارتباطيه عالية مع الأحماض النووية، الشكل (1) ولإنجاز التهجين فإن الأمر يتطلب دنترة الحامض النووي إما بمركبات قلوية أو بالتسخين أو بالإخماد Quenching أو بالمركب "الفورمامايد" Formamide أو بالفورمالديهايد أو بالمركب الكلايوكسال" Glyoxal حيث يكون المركبين الأخيرين معقدات مع الحامض النووي، يعقب ذلك مرحلة ربط الحامض النووي بالغشاء وتثبيته عليه ليصبح غير متحرك Immobilized وذلك بتسخينه تحت التفريغ عند 80م لمدة تتراوح بين نصف ساعة إلى ساعتين أو بتعريض سطح الغشاء الحامل للحامض النووي للأشعة فوق البنفسجية عند الطول الموجي 254 نانومتر، ثم تعلم خيوط الحامض بمجستات معلمة اشعاعيا Radioactively labeled probe  بواسطة نظير مشع والتي تسمى أيضا "جزيئات إشارة" Reporter molecules وأكثر النظائر المشعة استعمالا هي الفسفور المشع ³²P والكبريت المشع S³⁵، (الشكل 2) أو تعلم المجسات بمادة غير إشعاعية حيث تستعمل الإنزيمات المغيرة للون وأهمها إنزيم الفوسفاتيز القاعدي Alkaline phosphatase أو إنزيم "بيروكسيديز فجل الخيل" Horseradish peroxidase او استعمال مادة باعثة للضوء Chemiluminescent System والتي تفضل على النظم اللونية الإنزيمية وذلك بسبب سرعة ظهورها وسهولة ملاحظة الضوء الذي يطلقه التفاعل والذي يمكن تحسسه بواسطة الأفلام الفوتوغرافية حيث ترتفع حساسية الكشف عن الفايروسات فيها لغاية عدة "فمتوغرامات" Femtograms ويعقب تعليم المجسات إنجاز عملية التهجين ثم تؤخذ النتائج بطريقة البصمة البقعية Dot-blot ببصم عينة الحامض النووي على الغشاء مباشرة أو باستعمال جهاز بلاستيكي بسيط يضخ العينة من خلال شقوق على الغشاء لذلك تسمى الطريقة أحيانا "البصم الشقي" Slot blots لينقل بعدها إلى الهلام لغرض الكشف النهائي بتقانة الترحيل الكهربي حيث تستعمل طريقة "البصمة الشمالية Northern blot للكشف عن الرنا الفايروسي وطريقة "البصمة الجنوبية" Southern blot مع الدنا الفايروسي كما استعملت طريقة "تهجين الحامض النووي ببصمة السحق" Squash-blot nucleic acid hybridization وهي تحوير بسيط للطريقة السابقة لتقدير الوقت اللازم لاكتساب فايروس تخطط الذرة" (MSV) بواسطة حشرات قفاز الأوراق، ويبين الشكل (3) نتائج هذا الاختبار.

2- طريقة "التهجين المحاليلية" Liquid-Liquid hybridization

يتم في هذه الطريقة وكما مبين في الشكل (1) تهجين الحامض النووي المستهدف مع مجس معلم إشعاعيا ويرسب الهجين مزدوج الخيط المعلم على ورق ترشيح بعد إزالة المجسات غير المرتبطة حيث تظهر النتائج بشكل بقع على الورقة ثم تحسب الفعالية الإشعاعية للمجسات المرتبطة، استعملت هذه الطريقة للكشف عن العديد من فايروسات Polyviruses وأيضا لإظهار حالات التباين بين السلالات باستعمال مجسات مصممة لمناطق معينة من الجينوم الفايروسي ومنها "المنطقة 3 غير المشفرة 3 non Coding region وهذا يزيد من حساسية الكشف لغاية 1-5 بيكو جرام فايروس.

تستعمل كلا الطريقتين المذكورتين أعلاه لغرض التقدير الكمي للتعاقبات النيوكليوتايدية المراد اختبارها إلا أن لطريقة التهجين ذات الطور الخليط (الصلب) وظيفة خاصة إضافية وهي تحديد مواقع التعاقبات التي ثبتت على غشاء النايتروسيليلوز من خلال استعمال طريقتي البصمة الشمالية والبصمة الجنوبية للكشف عن الرنا والدنا على التوالي.

الشكل (1): طريقتي تهجين الحامض النووي Nucleic acid hybridization

 (أ) طريقة التهجين ذات الطور الخليط (الصلب) Solid-phase hybridization والتي تتم وفق الخطوات (أ) ربط مزيج معقد من الأحماض النووية بغشاء النايتروسيليلوز أو النايلون (ب) إضافة المجس المعلم والسماح بحدوث التهجين مع التعاقب النيوكليوتايدي المستهدف (مع جزء من الجينوم) (ج) إزالة المجسات غير المرتبطة ثم قياس كمية المجسات المرتبطة.

(ب) طريقة التهجين المحاليلية Liquid-phase hybridization والتي تتم وفق الخطوات (أ) تحضير محلول يضم مزيج معقد من الأحماض النووية (ب) إضافة المجس المعلم والسماح بحدوث التهجين مع التعاقب النيوكليوتايدي المستهدف أي مع جزء من الجينوم (ج) إزالة المجسات غير المرتبطة ثم قياس كمية المجسات المرتبطة.

الشكل مقتبس من ) Cann (2005.

الشكل (2): تهجين الحامض النووي الرايبي أو منقوص الأكسجين باستعمال "مجس دنا معلم" Labeled DNA probe.

الشكل مقتبس من Carter و Saunder ((2007.

الشكل (3): النتائج المستحصلة من طريقة "تهجين الحامض النووي ببصمة السحق" Squash-blot nucleic acid hybridization لحساب الوقت اللازم لاكتساب فايروس "تخطط الذرة" (MSV) بواسطة ذكور وإناث قفاز الأوراق Cicadulina mbia حيث تمثل كل بقعة عينة لحشرة واحدة حاملة للفايروس ويلاحظ أن بعض الأفراد اكتسبت الفايروس بعد ست ساعات من التغذية على النبات المصاب وكانت كل الإناث والذكور المختبرة بعد سبعة أيام من التغذية حاملة للفايروس.

الشكل مقتبس من Hull  (2002).

4. المجسات

المجسات Probes هي إما قطعة من الرنا أو الدنا مفردة أو مزدوجة الخيط وبطول يتكامل مع تعاقبات الحامض النووي المستهدف، وحيث أن ما يزيد عن 75% من فايروسات النبات هي ذات جينوم من النوع ssRNA عليه فان المجس الأكثر شيوعا هو نسخة الدنا" cDNA والذي يخلق بطريقة الاستنساخ (الكلونة) Cloning من الرنا الفايروسي بواسطة إنزيم الاستنساخ العكسي Reverse transcriptase ويتم ذلك إما مباشرة أو في بلازمد بكتيري أو في ناقل عاثي Phage Vector وإن طريقة الاستنساخ هذه تعطي مجسات متجانسة لا نهاية لأعدادها وهي سهلة التحضير وتصمم لأغراض معينة منها تحديد العلاقة بين سلالات فايروس معين، وتم استنساخ مجسات للدنا مفرد الخيط ssDNA باستعمال العاثي البكتيري ووجد أن للمجسات الرايبية RNA probes ميزة إنتاج "مزدوجات" Duplexes أقوى من قدرة الحامض المستهدف، أما المجس الرايبي المزدوج dsRNA probe فان إعداده ممكن نظريا إلا أنه من صعب عمليا لذا فالطريقة الأفضل هي استنساخ نسخة الدنا" في ناقل يقوم بعملية الاستنساخ Transcripting vector ليعقبه تخليق "الرنا التكاملي"  Complementary RNA خارج النسيج الحي.