آلية الكيموتربسين مبنيه على اساس التحلل المائي للاسترات العضوية البسيطة مثل p-nitrophenylacetate واسترات المثيل لمضاهيات الاحماض الامينية مثل formyl phenyl alanine methyl esters و acetyl phenylalanine methyl ester وفي الية الكيموتربسين، فأن  p- nitrophenylacetate يرتبط مع الانزيم لتكوين معقد ES الذي يليه خطوة ثانية سريعة الذي فيها تكوين مركب وسطي acyl - enzyme مع ارتباط مجموعة خلات تساهميا الى السيرين في الموقع 195 مما يحصل تحرير مجموعة نترو فنيل بشكل nitrophenolate تحصل مهاجمة جزيئة الماء على المركب الوسطي acyl enzyme لانتاج الخلات بشكل منتوج ثانوي مما يتحرر الانزيم ليرتبط إلى جزيئة اخرى من بارا - نتروفنيل الخلات لانتاج nitrophenolate ، انتاج الخلات هو خطوة محددة لسرعة التفاعل، الدور البيولوجي للكيموتربسين هو تحفيز التحلل المائي للبروتينات في الامعاء الدقيقة.

وهو لا يشقق كل الاواصر الببتيدية في نفس السرعة بالإضافة الى ذلك فهو يختار الأواصر الببتيدية على الجانب الكربوكسيلي من السلسلة الجانبية العطرية للتيروسين والتربتوفين والفنيل الأنين او من المجاميع غير المحبة للماء مثل المثيونين ويحلل الكيموتربسين اواصر الاستر بالرغم من عدم اهمية هذا التفاعل من الناحية الفسيولوجية لكن اهمية تكمن في كونه ذو علاقة قريبة الى تحلل الأواصر الببتيدية ويتم تحليل الاواصر الببتيدية والاستر في مرحلتين اولهما بواسطة دراسة اليات التحلل المائي للمركب P - nitrophenyl acetate ، ان تحرير بارا - نتروفينول يحتاج كمية كبيرة من الانزيم وهناك مرحلة بروز سريع أولي لبارا - نترو - فينول يلي تكوينها في مرحلة الحالة الانتقالية البطيئة، ففي الخطوة الاولى يحصل ارتباط بـار - نتروفنيل الخلات مع انزيم كيموتربسين لتكوين معقد مادة اساس - انزيم وتحرير بارا - نتروفينول يسبب تشقق رابطة الاستر للبارا - نتروفنيل الخلات الذي تعمل كمادة اساس للأنزيم ويحصل ارتباط مجموعة الخلات للمادة الاساس مع الانزيم بواسطة اصرة تساهمية والذي تهاجم مجموعة الخلات بواسطة الماء لتكوين ايون الخلات مع تحريره من المعقد ES، ان مرحلة البروز السريح الأولية لانتاج بارا - نتروفينول مقابل تكوين معقد الانزيم -- الخلات وهذه العملية يطلق عليها الاستلة، انتاج الحالة المستقرة البطيئة من بارا - نتروفينول مقابل التحلل المائي المعقد انزيم الخلات لتوليد انزيم حر يطلق عليه نزع الاستلة او ما يطلق عليها الخطوة الثانية وهي خطوة تحديد السرعة في التحلل المائي للاسترات بواسطة الكيموتريسين ويمكن اعادة الية الكيموتربسين حيث يحصل ارتباط تساهمي لمجموعة الخلات مع الانزيم حيث ترتبط مجموعة الخلات إلى الكيموتربسين تساهميا وعندما P₁ هي الامين او الكحول في المادة الاساس و E-P₂ هي المادة الوسطية التساهمية بينما P₂ هي المكون الحامضي للمادة الاساس.

الصفة المميزة لهذه الآلية هي حدوث مركبات وسطية تساهمية، حيث نلاحظ ان المجموعة المرتبطة الى الكيموتربسين في مرحلة P₂-E هي مجموعة اسيل لذلك يكون المركب الوسطي انزيم - اسيل ومجموعة الاسيل ترتبط إلى الحامض الاميني السيرين على سطح الانزيم فان موقع ارتباط مجموعة الاسيل هو الاوكسجين في الحامض الاميني السيرين الذي يكون ثابت في اس هيدروجيني 3 حيث يكون موقع الحامض الاميني السيرين في الانزيم هو 195 الذي يتفاعل مع Fluoro Phosphates مثل diisopropylphosphofluoridate, DIPF الذي يجعل الأنزيمات المحللة للبروتين غير فعاله مثل التريسين والكيموتربسين subtilisin, thrombin, elastase ويحدث فيها التفاعل في الحامض الاميني السيرين، لذلك يطلق على هذه الأنزيمات Serine proteases ومن الاحماض الامينية الأخرى المهمة في الية التحفيز للكيموتربسين هو المستدين في الموقع 57 حيث يكون الحامض الاميني المستدين في الموقع 57 مجاور إلى السيرين في الموقع 195 ومجموعة الكربوكسيل للحامض الاميني اسبارتيت في الموقع 102 مجاور لهما وتداخل الاحماض الامينية الثلاثة لزيادة القوة التحفيزية للكيموتربسين بحيث يرتبط الاسبارتيت في الموقع 102 بواسطة اصرة هيدروجينية الى الهستدين في الموقع 57 والذي ترتبط بواسطة اصرة هيدروجينية الى السيرين في الموقع 195 وبهذا تكون الاحماض الامينية الثلاثة ما يسمى. charge relay net work

وتشير نتائج دراسات الاشعة السينية بوجود جيب في الموقع الفعال لاحتواء السلاسل الطرفية العطرية وأن للحامض الاميني الاسبارتيك المدفون في داخل جزيئة الانزيم يلعب دوراً مهماً في عمل كل من الهستدين في الموقع 57 والسيرين في الموقع 195 وان المادة الاساس ترتبط بالسيرين في الموقع 195 والهستدين في الموقع 75 وعندما ترتبط المادة الاساس مع الانزيم الحر تصبح القوة النيكليوفيلية لأوكسجين السيرين في الموقع 195 عالية بسبب انتقال الشحنه السالبة من الاسبارتيت في الموقع 102 من خلال المستدين في الموقع 57 الذي يهاجم الاوكسجين لمجموعة الكربوكسيل للأنزيم الذي ترتبط مع المادة الاساس مكوناً مركباً وسطياً غير مستقر tetrahedral الذي يحتوي ذرة اوكسجين سالبة الشحنه غير ثابته ثم يزداد ثابت ذرة الاوكسجين بسبب تكوين اصرة هيدروجينية مع مجموعة-NH الذي تعود الى الحامض الاميني الكلايسين في الموقع 193 حيث تعمل مجموعة الاميدازول الذي تعود الى الحامض الأميني الهستدين في الموقع 57 كعامل تحفيزي حامضي مما يسهل ذلك تحرير الناتج الأولي للتفاعل AH تاركا اسيل الانزيم ونتيجة الهجزم النيكليوفيلي وبسبب وجود الماء يتحرر ناتج ثاني R-COOH ويعمل الحامض كعامل تحفيز ويلعب net work دوراً مهماً في التحفيز بسبب ربط البروتون وتستقطب مجموعة الكربوكسيل المطمورة للحامض الاميني الاسبارتيت في الموقع 102 مجموعة الاميدازول للهستدين في الموقع 57 مما تزداد سعته للعمل كمكوك بروتون حيث تتقبل الحامض الاميني الاسبارتيت في الموقع 102 والهستدين في الموقع 57 البروتون من السيرين في الموقع 195 وخاصة من مجموعة الهيدروكسيل خلال المهاجمة النيكليوفيلية بواسطة الاوكسجين الموجود على سطح المادة الاساس، يساهم الهستدين في الموقع 57 والسيرين في الموقع 195 بصورة مباشرة في تشقق اصرة الببتيد الحساسة للمادة الاساس حيث يبدأ التحلل المائي للأصرة الببتيدية عند مهاجمة الأوكسجين في مجموعة الهيدروكسيل للحامض الاميني السيرين في الموقع 195 على ذرة الكربون الكربونيلية في اصرة الببتيد الحساسة مما تصبح اصرة الاوكسجين - الكربون في مجموعة الكربونيل مفردة وذرة الاوكسجين تكتسب شحنه سالبه الذرات الاربعة المرتبطة الى كربون الكربونيل تترتب بشكل tetrahydron رباعي السطوح وتكوين المركب الوسطي رباعي السطوح من مجموعة الامايد يسهل من تكوين اواصر هيدروجينية بين ذرة الاوكسجين الكربوكسيلية ذات الشحنه السالبة الذي تسمى oxyanion ومجاميع NH للمسلسلة الرئيسية.

يوضح الشكل اعلاه المركب الوسطي رباعي السطوح في تفاعلات الاستلة وازالة الاستلة للكيموتربسين الاصرة الهيدروجينية المتكونة بواسطة المجموعتين من السلسلة الرئيسية للأنزيم تساعد على ثبات المركب الوسطي مما يحصل نقل بروتون من السيرين في الموقع 195 الى الهستدين في الموقع ،57 يسهل نقل البروتون بسبب وجود charge relay net work ، الاسبارتيت في الموقع 102 يوجه حلقة الاميدازول في المستدين في الموقع 57 مما يعادل الشحنه جزئيا على الحلقة، البروتون المخزون بسبب ارتباط المستدين الاسبارتيت يوهب الى ذرة النتروجين لآصرة الببتيد الحساسة ونتيجة لذلك يحصل تشقق تلك الاصرة فان مكونات الامين ترتبط مع المستدين في الموقع 57 بواسطة اصرة هيدروجينية بينما مكونات الحامض للمادة الاساس تتاستر مع السيرين في الموقع 195 ما تنتهي مرحلة الاستلة للتفاعل التحللي ثم تبدأ مرحلة ازالة الاستلة وتبتعد مكونات الامين للمادة الاساس عن طريق الانتشار مما تأخذ جزيئة الماء مكانها في الموقع الفعال وازالة الاستلة هي عكس الاستلة مع استبدال ماء لمكونات الامين حيث يتم سحب بروتون بعيدا عن الماء مما تبقى مجموعة الهيدروكسيل الذي تهاجم ذرة الكربون الكربونيلية لمجموعة الاسيل التي ترتبط الى السيرين في الموقع 195 مما يحصل تكوين مركب وسطي رباعي السطوح مما يجعل المستدين في الموقع 57 يهب بروتون الى ذرة الاوكسجين في السيرين 195 ما يحرر مكونات الحامض للمادة الاساس والذي يتم انتشار مكونات الحامض بعيدا بينما يصبح الانزيم جاهز لعملية تحفيز أخرى.