تعتبر نسبة الأكسجين المستهلك في العمليات الحيوية أكثر أهمية من تحديد الأكسجين المنحل. تشير القيم المنخفضة جداً من BOD إما إلى أن الماء نظيف، حيث أن البكتيريا الموجودة لا تقوم باستهلاك المركبات العضوية الموجودة، أو أن البكتيريا الموجودة ميتة أو أنها تموت أن قيمة متطلب أو استهلاك الأكسجين في العمليات الحيوية التي تقوم بها الكائنات الحية الدقيقة في الماء، يشار إليه بتعبير الاستهلاك الحيوي أو المتطلب الكيميائي الحيوي من الأكسجين(BOD).

لا يعتبر استهلاك الأكسجين الحيوي بحد ذاته عامل تلوث ولكنه مؤشر إلى كمية الأكسجين الذي تستهلكه الكائنات الدقيقة والبكتريا المشاركة في عملية التفكك العضوي. أن الاختبارات الأولى لتحديد استهلاك الأكسجين الحيوي تجرى لتحديد الأكسجين في مجرى مائي من خلال غمر زجاجتين، يتم تحديد كمية الأكسجين المنحل في الزجاجة الأولى في حين تبقى الزجاجة الأخرى في المجرى لعدة أيام، ومن ثم يتم تحديد كمية الأكسجين المنحل فيها في الزجاجة الثانية. إن الفرق في مستوى الأكسجين المنحل يحدد استهلاك الأكسجين الحيوي، ويعبر بو احدة تركيز ملغ من الأكسجين لكل ليتر من العينة mg/L. يمتلك هذا الاختبار ميزة هامة حيث أن الماء في الزجاجة يخضع لذات العوامل البيئية المؤثرة على الماء في المجرى، ولذلك يعتبر مقياس دقيق لكمية استخدام الأكسجين المنحل في المجرى من المستحيل مقارنة نتائج  أكثر من مجرى بسبب وجود ثلاث متغيرات هامة غير ثابتة وهي درجة الحرارة والزمن والضوء.

إن لدرجة الحرارة تأثير واضح على امتصاص الأكسجين، وذلك بسبب زيادة نشاط التمثيل الغذائي بشكل ملحوظ عند درجات مرتفعة من الحرارة. كما أن الزمن المخصص للاختبار مهم أيضاً، حيث أن كمية الأكسجين المستهلك تزيد بإزدياد الزمن.

إضافة إلى أن الضوء عامل مهم أيضاً، حيث أن المياه الطبيعية تحتوي على طحالب وأكسجين يمكن أن تنمو ضمن الزجاجة في حال توافر الضوء. فاختلاف كمية الضوء سيؤثر على التركيز النهائي للأكسجين. إن اختبار استهلاك الأكسجين الحيوي المعياري يتطلب أن يتم القياس في الظلام عند الدرجة 20 مئوية لمدة خمسة أيام. إن استهلاك الأكسجين الحيوي لمدة خمسة أيام، هو الأكسجين الذي تستخدمه الكائنات الحية الدقيقة في عينة من المياه خلال هذه الأيام الخمسة الأولى بعد أخذ العينات. إن اختيار خمسة أيام هو حل وسط بين عمل اختبار لمدة غير طويلة بما فيه الكفاية للحصول على نتائج ، أو عمل الاختبار لمدة طويلة بحيث أن البكتيريا اللاهوائية والعفن في الزجاجات تؤثر على استهلاك الأكسجين الحيوي.

يتبع منحني أكسدة استهلاك الاكسجين الحيوي إلى إنخفاض أسي، كما هو مبين على سبيل المثال في الشكل (6-1)، ويكون عادة ثابت الإنخفاض في الأيام الخمسة الأولى في أغلب عمليات أكسدة الأكسجين الحيوي. يمكن تحديد مدة يومين أو عشرة أيام، أو أي مدة أخرى لتحديد استهلاك الأكسجين الحيوي, كما يستخدم في بعض الحالات مفهوم استهلاك الأكسجين الحيوي اللامتناهي أو استهلاك الأكسجين بعد فترة طويلة جداً.

يتم عادة إجراء اختبار استهلاك الأكسجين الحيوي ضمن زجاجات قياسية خاصة.

يتم الفحص أولاً بقياس الأكسجين المنحل أو بإشباع العينة بالأكسجين المنحل عند نفس درجة الحرارة التي سيتم تخزينها عندها ، يتم التخزين عادة عند الدرجة °20 مئوية. يقاس بعد ذلك الأكسجين المنحل في العينات كل يوم ولمدة خمسة أيام، وستكون المنحنيات الناتجة عن القياسات مماثلة لتلك المنحنيات المبينة في الشكل (6-2).

في هذا المثال، تحتوي العينة الأولى A على تركيز أولي للأكسجين المنحل مقداره ( 8 ملغ/ لتر) ، ينخفض خلال خمسة أيام إلى 2 ملغ / لتر . وبالتالي فإن استهلاك الاوكسجين الحيوي 8 - 2  = 6 ملغ / لتر . والعينة الثانية B تحتوي على الأكسجين الأكسجين الحيوي 8 المنحل بتركيز 8 ملغ / لتر أيضاً، ولكن تم استهلاك الأكسجين بسرعة بحيث إنخفضت إلى الصفر عند اليوم الثاني. وبما أنه لا توجد إمكانية لقياس الأكسجين المنحل بعد 5 أيام، وبالتالي فإن استهلاك الأكسجين في العينة الثانية يجب أن يكون أكثر من8 - 0 = 8 ملغ لتر، ولكن لا يمكن تحديد الاستهلاك بدقة حيث أن الكائنات الحية في مثل هذه العينة من الممكن أن تحتاج لكميات من الأكسجين أكثر من الكمية المتوفرة. إذن في مثل هذه العينات لا بد من تكرار تجربة قياس استهلاك الأكسجين الحيوي خلال فترة خمسة أيام ولكن بعد تمديد العينة. في حال افتراض أن العينة الثالثة في الشكل (6-2) هي العينة الثانية B ولكن بعد تمديدها بنسبة 10:1، وبالتالي فإن قيمة المتطلب الحيوي من الأكسجين في العينة الثانية B سيكون وفقا لذلك :

من الممكن قياس متطلب الأكسجين الحيوي لأي مادة عضوية (السكر على سبيل المثال) وهذا يساعد في تقدير تأثيرها على مجرى الصرف الصحي، على الرغم من أن المادة في حالتها الأصلية قد لا تحتوي على الكائنات الحية الضرورية لتفكيكها وبالتالي فإن الزرع هو عملية إضافة الكائنات الحية التي تقوم بأكسدة الأكسجين الحيوي إلى زجاجات الاختبار. ويستخدم الزرع أيضاً من أجل قياس تراكيز منخفضة جداً لاستهلاك الأكسجين الحيوي.

إذا افترضنا أننا استخدمنا العينة الأولى في المنحني السابق كماء للزرع، حيث أنها بالتأكيد تحتوي على كائنات حية استهلاك الأكسجين الحيوي خلال خمسة أيام 6

ملغ ليتر)

نضيف 100 مل من محلول غير معروف إلى زجاجة ثم نضيف إليها 200 مل من ماء الزرع، وبالتالي الحجم الكلي 300مل على افتراض أن تركيز الاكسجين المنحل البدائي كان 8 ملغ ليتر والنهائي كان 1 ملغ / ليتر ، وبالتالي فإن كمية الأكسجين الكلي المستهلك هو 7 ملغ ليتر . بكل الأحوال يعود قسم من هذا الاستهلاك إلى ماء الزرع بما أنه لديه استهلاك للأكسجين الحيوي، ويعود قسم إلى المادة غير المعروفة. وبالتالي فإن كمية الاكسجين المستخدمة من ماء الزرع هي :

حيث أن نسبة ماء الزرع تشكل ثلثي زجاجة الاختبار واستهلاك الاكسجين الحيوي 6 ملغ / ليتر . أما كمية الاكسجين الباقية 7-4 - 3 ملغ / ليتر فلا بد من أنه قد تم استخدامها من المحلول المجهول. يمكن استخدام المعادلة التالية لحساب استهلاك الاكسجين الحيوي وهي تشمل عمليتي التمديد والزرع :

حيث أن :

I: تركيز الأكسجين المنحل البدائي في العينة وماء الزرع

:F تركيز الأكسجين المنحل النهائي في العينة وماء الزرع

'I: تركيز الأكسجين المنحل البدائي في ماء الزرع

'F: تركيز الأكسجين المنحل النهائي في ماء الزرع

X: حجم ماء الزرع في حوجلة العينة (مل)

Y: الحجم الكلي للمحلول (مل)

D: نسبة تمديد العينة.

إن استهلاك الأكسجين الحيوي هو مقياس لمتطلب الأكسجين، أو إمكانية استهلاك الأكسجين إن الاستهلاك المرتفع من الأكسجين الحيوي ضمن التدفق قد يكون له تأثير ضار على المجرى، وخاصة إذا كان الاستهلاك كبيرا بما فيه الكفاية لتحقيق الشروط اللاهوائية. من الواضح أن تدفق صغير ضمن مجرى كبير من النهر لن يكون له أي تأثير يذكر وذلك بغض النظر عن تركيز استهلاك الأكسجين الحيوي. وبشكل مشابه، فإن حدوث تدفق كبير لماء ملوث ضمن تيار مائي صغير من المحتمل أن يكون له تأثير خطير على المجرى، على الرغم من أن تركيز استهلاك الأكسجين الحيوي قد يكون منخفضاً أن تركيز استهلاك الأكسجين الحيوي لمعظم مياه الصرف الصحي المنزلي حوالي 250 ملغ / لتر ، والعديد من الصناعات تطرح نفايات بتراكيز مرتفعة لاستهلاك الاكسجين الحيوي تصل حتى 30,000 ملغ ليتر إن تحديد الأثر المحتمل عن نفايات الألبان غير المعالجة والتي يبلغ استهلاك الأكسجين الحيوي فيها 20,000 ملغ/ليتر واضح تماماً.

يمكن التعبير عن منحنى استهلاك الأكسجين الحيوي بالمعادلة التالية:

حيث:

y: كمية الأكسجين المستهلكة خلال وقت محدد مقدراً بواحدة الـــ ملغ/ليتر.

L₀: الحد الأعظمي لاستهلاك الاكسجين مقدراً بواحدة الـــ ملغ/ليتر.

K: ثابت تفكك الأكسجين.

t: الزمن مقدراً بالأيام.

في حال تركت التفاعلات لكي تستمر عوضاً عن إيقاف فحص استهلاك الأكسجين الحيوي بعد خمسة أيام، وحددنا الأكسجين المستهلك يومياً فإننا قد نحصل على منحنى كما هو موضح في الشكل (6-3).

يلاحظ أنه في بعض الحالات بعد خمسة أيام فإن المنحني قد يرتفع بشكل حاد. تعود هذه الفجوة إلى استهلاك الأكسجين من قبل الكائنات الحية الدقيقة التي تحلل المركبات العضوية النيتروجينية إلى نترات مستقرة NO₃، وبالتالي فإن المنحنى ينقسم إلى منطقتي استهلاك الأكسجين الحيوي الآزوتية والكربونية. وبالتالي فإن الحد الأعلى لاستهلاك الأكسجين الحيوي الموضح في الشكل يتضمن استهلاك الأكسجين الحيوي الكربوني والآزوتي. ضمن الجداول والأنهار حيث زمن الجريان يتجاوز خمسة أيام، أن الحد الأعلى لاستهلاك الأكسجين يجب أن يتضمن الاستهلاك الآزوتي على الرغم من أن استخدام BOD_ult الكربونية والآزوتية من أجل حساب إنخفاض منحني الأكسجين المستهلك لا تعتبر دقيقة تماماً، فإنه غالباً ما يفترض أن حساب الحد الأعلى لاستهلاك الأكسجين الحيوي يحسب كما يلي: