تقانة زراعة الجذور الشعرية Hairy root culture

تعد الطبيعة مصدر إلهام للإنسان، ومنها يكتشف الكثير من المعلومات المهمة التي لها آثار تطبيقية في المجالات المختلفة.

لاحظ العلماء إصابة بعض جذور النباتات البرية بمرض بكتيري يدعى مرض الجذور الشعرية الشكل (1)، وهو مرض يصيب الجذور وتتكون في منطقة الإصابة جذور ليفية رفيعة وكثيفة. قام علماء أمراض النبات بدراسة هذا المرض في الطبيعة، واستطاعوا تحديد المسبب وهو نوع من البكتريا السالبة التي تعيش في التربة وتدعى الأغروباكتريوم ريزوجين Agrobacterium rhizogene، تحوي البكتريا على بلاسميد يحمل مورثات تعمل على تحفيز تكوين الهرمونات النباتية بتراكيز عالية (الأوكسينات والسيتوكينينات)

الشكل :(1) مرض الجذور الشعرية في الطبيعة

عند تعرض جذور النباتات في الطبيعة إلى جروح، تهاجم بكتريا الأنسجة الجذرية وتدخل إلى داخل الخلايا النباتية فينتقل البلاسميد إلى داخل الخلايا ويندمج مع جينوم الخلايا النباتية. تنتقل المورثات البكتيرية وتندمج مع جينوم الأنسجة النباتية الجذرية ويحفزها لإنتاج الهرمونات النباتية التي تحفز تكوين ونمو الجذور الليفية مسببة ظهور المرض في جذور النباتات المصابة.

أدت هذه الاكتشافات إلى تطوير تقانة مهمة في مجال التقانة الحيوية النباتية وهي زراعة الجذور الشعرية Hairy root culture التي تعد إحدى تقانات التعديل الوراثي يمكن استخدامها في نقل بعض المورثات المهمة من نبات إلى نبات آخر.

تعاريف خاصة بالجذور الشعرية Terminology:

 -1زراعة الجذور الشعرية: عبارة عن زراعة أجزاء نباتية مختلفة مع الأغروباكتريوم ريزوجين Agrobacterium rhizogene ضمن شروط معقمة بهدف نقل البلاسميد Ri plasmid من البكتريا إلى داخل الخلايا النباتية واندماجه مع جينوم الخلايا مما يحفز على اصطناع الهرمونات النباتية وتحريضها في تكوين الجذور الشعرية ونموها واكثارها.

2- الأغروباكتريوم: بكتريا سالبة من بكتريا التربة ويوجد منها نوعين، تستخدم في التقانة الحيوية النباتية:

- النوع الأول: أغروباكتريوم ريزوجين: يستخدم في تقانة الجذور الشعرية.

النوع الثاني: أغروباكتريوم تومافيسينس Agrobacterium tumafesciens ويستخدم في النقل المورثي والحصول على نباتات معدلة وراثياً.

3- البلاسميد Plasmid: هو جزء من البلاسميد البكتيري، يوجد في الأغروباكتريوم وهو قطعة من الDNA  ، ri DNA أو T-DNA تحوي حوالي 20000 جزء من الـ DNA ويحوي مجموعة من الجينات التي تعمل على تكوين الأنزيمات المحفزة لاصطناع الأوكسينات والسيتوكينينات، كما تحوي الأنزيمات الخاصة باصطناع الأوبينات Opines التي تعد مصدر غذاء للبكتريا (آزوتي، والطاقة).

كما هو موضح بالشكل (2).

4- الأوبين Opines: مركبات عضوية توجد في الجذور الشعرية أو في التدرن السرطاني البكتيري، يتم اصطناعها من قبل المتطفل Agrobacterium rhizogene حيث توجد الأنزيمات المسؤولة عن اصطناع الـ Opines في البلاسميد البكتيري الذي يتم نقله إلى الخلايا النباتية ويسخرها لاصطناع الـ Opies تستخدم البكتريا المتطفلة هذه المركبات كمصدر للآزوت والطاقة.

يوجد حوالي 30 مركب مختلف من الـ Opines تم اكتشافها لحد الآن، وصنفت ضمن عدة عائلات مثل Manopines. Agrocinopines ، Octopines ، Agropines

تكوين نظام الجذور الشعرية Establishment of a hairy root culture system

يتم زرع وإنشاء نظام زراعة الجذور الشعرية وفق الآتي:

- يتم عزل الأجزاء النباتية المراد استخدامها، ثم تعقم وتزرع بنفس الطرائق التي استخدمت في التكاثر الخضري الدقيق.

- تزرع العينات النباتية زراعة أولية في وسط مغذ لمدة قصيرة 2-3 أيام.

- تنقل الخزعات النباتية وتجرح بمشرط صغير وتزرع مع البكتريا أغرو باكتريوم ريزوجين لمدة 2-3 أيام وذلك حسب الأنواع النباتية لإعطاء فرصة للبكتريا بمهاجمة الخلايا النباتية واختراقها.

- تنقل العينات فيما بعد إلى وسط جديد على أن يضاف له مضاد حيوي، أو مزيج من المضادات الحيوية للتخلص من البكتريا والقضاء عليها بشكل كامل.

- تنقل العينات النباتية بعد فترة أسبوع إلى أسبوعين إلى وسط جديد خال من المضادات الحيوية للسماح بتشكل الجذور الشعرية. كما هو موضح بالشكل (3).

- تختلف الفترة الزمنية اللازمة لتكوين الجذور الشعرية بحسب الأنواع النباتية، ففي بعض الأنواع تظهر بعد أسبوع من الزرع، وفي بعض الأنواع الأخرى تحتاج إلى فترة شهر حتى تظهر بشكل واضح الجذور الشعرية.

- يتم نقل الجذور الشعرية مرة بالشهر إلى وسط جديد حتى تسمح بنمو وإكثار الجذور الشعرية، ولا يحتاج الوسط إلى إضافة هرمونات نباتية لأن الجذور الشعرية تكوّن هرمونات داخلية بشكل مستمر بفعل المورثات التي نقلت من بلاسميد الأغروباكتريوم.

تتصف الجذور الشعرية بنموها السريع والعشوائي والمستمر والمستقر في أوساط مغذية خالية من الهرمونات النباتية، وتعمل على إنتاج مواد فعالة التي تستخدم في الصناعات الدوائية والتجميلية والغذائية.

تتصف الجذور العادية الغير محورة وراثياً بالنمو البطيء، وعدم تشكيل جذور ليفية وتحتاج إلى إضافة هرمونات نباتية إلى الوسط المغذي حتى تنمو.

العوامل المؤثرة في تكوين الجذور الشعرية Factors affecting hairy root culture

الأنابيب، تختلف العوامل المؤثرة باختلاف الأنواع النباتية، ولا بد من الإشارة بأن العوامل التي تؤثر في نمو الجذور الشعرية وإكثارها ليس لها التأثير نفسه فيما يتعلق بإنتاج المواد الفعالة.

تؤثر عوامل عديدة في نجاح تكوين الجذور الشعرية داخل من

1- تأثير سلالة البكتريا المستخدمة:

تختلف قدرة التعديل الوراثي للأغروباكتريوم ريزوجين، وذلك حسب السلالة المستخدمة. وقد لوحظ اختلافات كبيرة بين سلالات البكتريا المستخدمة في قدرتها في تكوين الجذور الشعرية، وفي قدرتها في نمو الجذور الشعرية وإكثارها، وفي تكوين المواد الفعالة.

قسمت سلالات الأغروباكتريوم ريزوجين إلى خمس مجموعات أو عائلات وذلك حسب مركبات الـ Opines التي تنتجها لتغذية البكتريا وهي:

- مجموعة Octopines

- سلالات الـ. Agropines

- سلالات الـ. Nopalines

- سلالات الـ Manopines

- سلالات Zhou et al., 1998). Cucumopines)

تختلف السلالات وقدرتها لتكوين الجذور الشعرية وإنتاج المواد الفعالة، فقد لوحظ أن سلالات الـ Agropines أعطت أكبر قدرة في تكوين الجذور الشعرية في نبات الفول السوداني Peanut ، وخاصة السلالة Kim et al., 2008). R1601)

ولوحظ انتخاب تحت سلالات أو سلالات من السلالة نفسها، وأبدت هذه تحت سلالات اختلافات واضحة بقدرتها في تكوين الجذور الشعرية وفي إنتاج المادة الفعالة ففي تجربة أجريت في نبات الأرتيميزيا آنا Artemisia anna حيث استخدمت عدة تحت سلالات من السلالة R1601 في تكوين الجذور الشعرية وفي قدرة الجذور الشعرية المتكونة لتكوين مادة الآرتيميزنين . (2001 ,.Artemisinin (Deyu et al

ويوضح الجدول (1) قدرة تحت السلالات المتكونة في تكوين الجذور الشعرية وفي قدرتها في تكوين المادة الفعالة، حيث استخدم 0.2 غ / بالدورق (مادة جافة) يحوي 100مل من الوسط المغذي السائل يحوي المحلول المعدني MS مع 250مغ/ كنامايسين.

جدول (1) تأثير تحت السلالات في نمو وإكثار الجذور الشعرية بنبات الآرتيميزيا آنا، وإنتاج مادة الآرتيميزنين. (2001 ,.Deym et al)

2- تأثير طبيعة الخزعة النباتية المستخدمة:

يتم الحصول على الجذور الشعرية في العديد من الأنواع النباتية من أجزاء نباتية مختلفة مثل: السويقة الجنينية، الفلقات الأوراق، القمم النامية، أعناق الأوراق، الجذور، السلاميات، والدرنات والبروتوبلاست (2009 ,.Magnier, 1988; Jian et al). تختلف أفضل الأجزاء النباتية من نبات إلى آخر، ففي نبات السالفيا Salvia miltiorrhiza أعطت الأوراق أكبر ما يمكن من الجذور الشعرية عند تلقيحها بالأغروباكتريوم ريزوجين (2007 ,.(Hsia et al كما هو موضح بالشكل (3).

ففي تجربة نفذت في نبات اللوتس Lotus coniculatus إذ استخدمت أربعة أنواع من الأجزاء النباتية وهي: الجذور - السلاميات - الأوراق والعقل الطرفية أو الجانبية. حيث لقحت العينات المذكورة بالبكتريا A.R، وحسبت نسبة العينات المعدلة وراثياً والتي كونت جذور شعرية كما هو موضح بالشكل (4) وقد أظهرت النتائج أن العقل الصغيرة أعطت أفضل النتائج .(2009 ,.Jian et al).

الشكل (4): تأثير طبيعة العينات النباتية في تكوين الجذور الشعرية في نبات اللوتس.

A جذر - B سلاميات - C أوراق - D عقل صغيرة.

3- تأثير عمر الأجزاء النباتية المستخدمة:

يلعب عمر الأجزاء النباتية دوراً مهماً في قدرتها على تكوين الجذور الشعرية، وبشكل عام كلما زاد عمر العينات النباتية كلما قلت قدرتها بالاستجابة للتعديل الوراثي بالبكتريا، وانخفضت نسبة الشعرية المتكونة.

ففي تجربة على نبات السوس Glycyrrhiza glabra، استخدمت أجزاء نباتية ورقية متكونة داخل الأنابيب بأعمار مختلفة من 2-3-4-5 أسابيع وقد استخدمت سلالة A R. KS99 في عملية التلقيح لتكوين الجذور الشعرية. وقد لوحظ بأن أفضل عمر للأوراق كان بين 3-4 أسابيع فقد أدت إلى تكوين أكبر كمية من الجذور الشعرية بعد 85 يوماً من الزراعة. في حين الأوراق أكثر عمراً كونت جذور شعرية بكمية أقل، كما هو الحال في الأوراق الفتية جداً (Mehrotra et al., 2008).

4- تأثير الزراعة التمهيدية:

تؤثر الزراعة التمهيدية لفترة من الزمن في وسط مغذ في قدرة العينات النباتية في تكوين الجذور الشعرية والمعاملة بالبكتريا أغروباكتريوم ريزوجين.

ففي تجربة أجريت في نبات اللوتس Lotus corniculata، حيث زرعت العينات النباتية في وسط مغذ لفترة زمنية بين 0-6 أيام، ثم نقلت وزرعت بشكل مشترك مع البكتريا بعد فترة زمنية 4-5 أسابيع حسبت العينات النباتية المعدلة وراثياً التي كونت جذوراً شعرية. دلت النتائج أن الزراعة التمهيدية لمدة يومين أعطت أفضل نسبة للتعديل الوراثي كما هو موضح بالشكل (5).

الشكل (5) تأثير فترة الزراعة التمهيدية في تكوين الجذور الشعرية (2009 ,.Jian et al )

5- تأثير التركيب المعدني:

يؤثر التركيب المعدني للوسط المغذي في قدرة العينات النباتية في تكوين الجذور الشعرية وفي قوة نموها ومدى قدرتها في تكوين المواد الفعالة.

يختلف تركيب الوسط المغذي بحسب الأنواع النباتية، ففي نبات السالفيا Salvia miltiorrhiza أعطى الوسط الخاص بالأشجار الخشبية (WPM) نتائج أفضل من الوسط المعدني لموراشيج وسكوغ في تكوين الجذور الشعرية (2007 ,.Hsia et al) وفي قدرتها على النمو.

وتجدر الإشارة أنه ليس من الضروري أن يكون الوسط المعدني الذي يعطي أفضل نمو للجذور الشعرية، أن يكون هو الأنسب في إنتاج المواد الفعالة.

وبالعودة للمثال السابق فقد تم الحصول على أعلى نسبة من المواد الفعالة من الجذور الشعرية النامية في الوسط المعدني B5.

وجد في بعض الأحيان أنه يتم الحصول على أعلى معدل لنمو الجذور الشعرية، وأعلى نسبة من المادة الفعالة على نفس الوسط المعدني، كما هو الحال في نبات الروبيا Rubia ackane، تم الحصول على أعلى معدل من نمو الجذور الشعرية في وسط SH، كما تم الحصول على أعلى كمية من مادة Alizarin والـ Purpurin في نفس الوسط، بالمقارنة مع (Park and Lee, 2009) (B5,MS.

6- تأثير طبيعة الوسط:

تؤثر طبيعة الوسط المغذي في نمو الجذور الشعرية وفي إنتاج المواد الفعالة، ويختلف التأثير باختلاف الأنواع النباتية. ففي نبات السالفيا، كان معدل نمو الجذور الشعرية في الوسط السائل لثلاثة اصناف أكثر من معدل نمو الجذور الشعرية في الوسط الصلب، أما إنتاج المادة الفعالة التانشينون Tanshinone في الوسط الصلب كان أعلى بثلاث مرات من إنتاج هذه المادة من الجذور الشعرية النامية في الوسط السائل.

7- تأثير تركيز السكروز:

يختلف تأثير تركيز السكروز المضاف إلى الوسط المغذي بحسب الأنواع النباتية. فقد لوحظ بأن أعلى معدل لنمو الجذور الشعرية تم الحصول عليه في وسط مغذ يحوي 60غ/ل سكروز، وذلك بعد 6 أسابيع من زراعة الجذور الشعرية. بينما في القطن نوع Gossypium barbadense، فقد كان أفضل تركيز هو السكروز 30 غ/ل بدون هرمونات حيث كان معدل نمو الجذور الشعرية أعلى ما يمكن (2008 ,.Triplett et al).

8- تأثير إضافة الهرمونات النباتية:

يعمل التعديل الوراثي بالأغروباكتريوم ريزوجين إلى نقل المورثات المحفزة لتكوين الهرمونات إلى الخلايا النباتية مما يؤدي إلى اصطناع تراكيز عالية من الهرمونات التي تحفز تكوين الجذور الشعرية ونموها. لذلك لا تحتاج الجذور الشعرية إلى إضافة الأوكسينات إلى الوسط المغذي لنموها وإكثارها. في حين تفيد إضافة الهرمونات وتزيد في إنتاج المواد الفعالة تختلف الحاجة إلى إضافة الهرمونات النباتية بحسب الأنواع النباتية، ففي تجربة نبات القطن من النوع Gossypium barbadenser أوضحت النتائج بأن إضافة الأوكسين إلى وسط نمو الجذور الشعرية يعمل كعامل سلبي في نمو الجذور الشعرية (Triplett et al., 2008).

وقد لوحظ زيادة واضحة في نمو الجذور الشعرية، وفي إنتاج المادة الفعالة في بعض الأنواع النباتية مثل الأرتيميزيا أنا Artemisia annua زاد نمو الجذور الشعرية عند إضافة الجبريلين GA بتراكيز خفيفة 0.01-0.02 مغ/ل.

وقد أثبتت الدراسات إلى أن الأوكسينات وخاصة NAA بتراكيز مختلفة تعمل على زيادة إنتاج المادة الفعالة (الأرتيميزنين Artemisinin) وكان تأثير الـ IAA أقل فعالية في إنتاج المادة الفعالة من الـ NAA. أما الجذور الشعرية النامية في وسط بدون هرمونات ينخفض بشكل واضح إنتاجها من المادة الفعالة.

بعض المركبات الكيميائية التي تضاف إلى الأوساط المغذية كطلائع لتكوين المواد الفعالة، ففي القطن تبين إضافة حمض الساليسيليك Salicylic acid وميتيل جاسمونات Methyl jasmonate إلى زيادة واضحة في إنتاج مادة الجوسيبول Gossipole في الجذور الشعرية وقد يبلغ معدل الزيادة ضعف إلى ثلاثة أضعاف الشاهد ( 2008Triplet et al) ونشير بأن مادة الجوسيبول المنتجة في الجذور الشعرية للقطن تساوي للكمية الموجودة في جذور النباتات النامية في الحقل.

يختلف التركيز الأنسب من الهرمونات النباتية ونوعها بحسب الأنواع النباتية، ففي نبات الروبيا Rubia ackane أعطى الأوكسين NAA بتركيز 0.5 مغ/ل أفضل معدل لنمو الجذور الشعرية وأفضل نسبة للمادة الفعالة المنتجة بالجذور الشعرية (الأنتراكينون Park) (and Lee 2009 (Antraquinon، في حين كان التركيز الأنسب في حال الآرتيميزيا بين 1-5 مغل من الـNAA.

9- تأثير الإضاءة:

تؤثر الإضاءة في نمو وإكثار الجذور الشعرية، وفي تكوين المواد الفعالة وقد يكون التأثير إيجابياً أو سلبياً وذلك حسب الأنواع النباتية.

ففي نبات السالفيا Salvia miltiorrhiza تنمو الجذور الشعرية، وتزداد الكتلة الحية بشكل كبير بمعدل مرة ونصف في الضوء بالمقارنة مع نموها بالظلام. ولكن يزداد تكوين المادة الفعالة (التانشیونین Tanshionine) بالظلام بالمقارنة مع نسبتها عند تعريض الجذور الشعرية للظلام (2007 ,.Hsia et al).

10- العوامل المرتبطة بالزراعة المشتركة مع البكتريا:

آ- تأثير فترة الزراعة المشتركة مع البكتريا: تؤثر فترة زراعة البكتريا Agrobacterium rhizogene في نسبة التعديل الوراثي. وتختلف الفترة المناسبة بحسب الأنواع النباتية وحسب السلالة البكتيرية ومدى شراستها.

ففي تجربة نفذت على اللوتس Lotus coniculatus

فقد زرعت عينات ورقية مع البكتريا لفترة زمنية من 1-6 أيام في وسط مغذ للتعديل الوراثي وقد لوحظ بأنه أفضل فترة للزراعة المشتركة هي ليومين حيث بلغت نسبة التعديل أعلى ما يمكن كما هو موضح بالشكل (6).

الشكل (6) تأثير بعض العوامل مثل فترة الزراعة المشتركة مع البكتريا الحرارة، وال pH في التعديل الوراثي وتكوين الجذور الشعرية في نبات اللوتس.

ب- تأثير PH الوسط المغذي في الزراعة المشتركة:

يؤثر PH الوسط المغذي بشكل كبير في التعديل الوراثي وتكوين الجذور الشعرية، وذلك أثناء الزراعة المشتركة للعينات النباتية مع البكتريا لمدة يومين في أوساط مغذية مختلفة الـ PH كالتالي: 5-5.2-5.4-5.6-5.8-6.

وحسبت نسبة التعديل الوراثي وقد لوحظ فروقات كبيرة في نسبة التعديل وذلك حسب درجة الـ PH. وكان أفضل نسبة تعديل في الـPH5.4 ، كما هو موضح في الشكل (6).

ج- تأثير درجة حرارة غرف النمو أثناء الزراعة المشتركة:

تؤثر درجة حرارة غرف النمو أثناء الزراعة المشتركة بين العينات النباتية مع البكتريا Agrobacterium rhizogene في نسبة التعديل.

تنخفض نسبة التعديل في درجات الحرارة المنخفضة تحت العشرين درجة مئوية كما تقل في درجات الحرارة العالية 28-30م، وأفضل درجة هي 22م، كما هو الحال في التعديل الوراثي لنبات اللوتس الشكل (6).

د- تأثير كثافة البكتريا في التعديل الوراثي:

تلعب كثافة البكتريا المضافة إلى وسط الزراعة المشتركة دوراً مهماً في نسبة التعديل الوراثي في نسبة تكوين الجذور الشعرية، ولابد أن تكون الكثافة البكتيرية مناسبة للحصول على نسبة جيدة من الجذور الشعرية.

الكثافة العالية والكثافة القليلة تنعكس سلباً في نسبة التعديل وتكوين الجذور الشعرية، تختلف الكثافة الأنسب بحسب النوع النباتي، مثلاً في نبات اللوتس تبين بأن الكثافة 600-OD أي بمعدل 600 ألف خلية بكتيرية في 1مل كما هو موضح بالشكل (7).

الشكل (7): تأثير كثافة البكتريا في التعديل الوراثي في اللوتس

وتقاس الكثافة Optical density على أساس =OD عدد البكتريا في 1مل من المحلول البكتيري. وتقاس بواسطة جهاز السبيكتروفوتوميتر Spectrophotometter

ونشير إلى أن السلالة البكتيرية المستعملة تؤثر بشكل كبير في نسبة التعديل، ونسبة تكوين الجذور الشعرية، وفي نسبة اصطناع المواد الفعالة.

هـ- تأثير المضاد الحيوي المضاف إلى الزراعة المشتركة:

يتوجب بعد إتمام عملية التعديل الوراثي، التخلص من البكتريا، والحد من نموها للسماح للعينات النباتية بالنمو وتكوين الجذور الشعرية يجب إضافة مضاد حيوي مناسب وفعال ضد السلالات البكتيرية المستخدمة، كما توجد عدة أنواع المضادات الحيوية التي تستخدم إما على شكل منفرد، أو مزيج من أكثر من مضاد حيوي، وتستخدم المضادات الحيوية الآتية:

- السيفاتكسيم Cefataxime sodium.

- الكاربنسللين Carbencillin.

- الفانكومايسين Vancomycin.

- الأمبيسيلين Ampicillin.

- الكلافورام Claforam.

- الستريبتومايسين Streptomycin.

- التتراسكلين Tetracyclin.

تستخدم بتراكيز من 100-500 ميكروغرام / مل، وتستخدم مزيجاً في بعض الأحيان لقتل البكتريا الأغروباكتريوم ريزوجين واستبعاده للسماح بنمو العينات النباتية وإكثارها & Hu

Du, 2006).

11- تأثير فترة نمو الجذور الشعرية:

تختلف الفترة الزمنية الخاصة بنمو وإكثار الجذور الشعرية بحسب الأنواع النباتية

بين 4-12 اسبوع (Hsia et al., 2007).

يمر منحنى النمو للجذور الشعرية بمرحلتين:

1- المرحلة الأولى: ويتم خلالها نمو الجذور الشعرية وإكثارها وفي هذه المرحلة التي تستمر عدة أسابيع 4-12 أسبوع، يتم زرع العينات النباتية في وسط مغذ مناسب وفي أغلب الأحيان لا تتم إضافة الهرمونات النباتية، ويفضل تنمية الجذور الشعرية بالإضاءة وعلى درجة حرارة 22 ±2م ليتم الحصول على أكبر كمية ممكنة من الكتلة الحية الرطبة او الجافة.

2- المرحلة الثانية: ويتم خلالها إنتاج المواد الفعالة من قبل الجذور الشعرية، وفي هذه المرحلة يفضل إضافة بعض الهرمونات النباتية وخاصة الأوكسينات، كما يفضل وضع العينات المزروعة في الظلام لإنتاج أكبر كمية ممكنة من المادة الفعالة.

لوحظ بأن إنتاج أغلب المركبات الثانوية يحدث بعد توقف منظم النمو أو على الأقل ليس خلال مرحلة نمو وإكثار الجذور الشعرية (2001 ,.Bourgaud et al) ، ففي نبات الآرتيميزيا آنا تم إنتاج مادة الآرتيميزنين بالزراعة على مرحلتين المرحلة الأولى لزيادة الكتلة الحية للجذور الشعرية والمرحلة الثانية لإنتاج المركبات الثانوية، وزادت كمية المادة المنتجة في هذا النظام بشكل كبير بالمقارنة مع الزراعة بالنظام الواحد.

وفي نبات السالفيا استمر نمو الجذور الشعرية في بعض الحالات إلى 12 أسبوعاً، وفي بعض الأحيان أو السلالات يتوقف النمو عند الأسبوع العاشر، ولكن يستمر إنتاج المواد الفعالة حتى 12 أسبوعاً. (2007 ,.Hsia et al ).

انتخاب سلالات الجذور الشعرية Selection of hairy root line:

يوجد اختلافات وراثية واسعة في سلالات الجذور الشعرية، ويعود السبب إلى التعديل الوراثي الحاصل بسبب الأغروباكتريوم ريزوجين مما يعطي سلالات الجذور الشعرية التي تختلف في قدرتها على النمو والإكثار وفي قدرتها في تكوين المواد الفعالة، وفي قدرتها في تكوين نباتات كاملة.

كما لوحظ بأن اختلاف في التركيب الوراثي لسلالات البكتريا المختلفة تسبب أيضاً اختلافات واضحة في قوة نمو الجذور الشعرية وإكثارها وقدرتها في تكوين المواد الفعالة.

كذلك لوحظ اختلافات بين سلالات الجذور المتكونة حسب مصدر وطبيعة العينات النباتية المستخدمة.

لذلك لابد من وضع برنامج لانتخاب سلالات الجذور الأكثر فائدة التي تتمتع بالصفات الآتية:

- سريعة النمو والإكثار.

- مستقرة وتعطي كمية كبيرة من الكتلة الحية.

- تنتج مواد فعالة بكمية جيدة ليصار إلى استثمارها من الناحية التجارية.

- استمرارية إنتاج المادة الفعالة لفترة زمنية طويلة، الثبات في الإنتاج.

ولابد أخيراً من الاحتفاظ بسلالات الجذور الشعرية جيدة الصفات وحفظها بزراعة النسج أو باستخدام تقانات الحفظ بالتجميد.

ويوضح الشكل (8) مثالاً آخر عن تكوين الجذور الشعرية في نبات فول الصويا بدءاً من الفلقات التي اخذت وعقمت وزرعت مع البكتريا ثم زرعت في وسط لتكوين الجذور الشعرية، كما يوضح الشكل نفسه طريقة الكشف عن التعديل الوراثي (2017 .Chen et al).

الكشف عن التعديل الوراثي في الجذور الشعرية (الجينات الكاشفة):

يتم نقل بعض المورثات بفعل البكتريا إلى العينات النباتية التي ستشكل الجذور الشعرية. يحمل البلاسميد بعض الجينات الكاشفة، سهلة الكشف والقياس، وعند الكشف عنها تعطي دليلاً على التعديل الوراثي، وتسمى هذه المورثات بالجينات الكاشفة. ويمكن أن تنتقل إلى الجذور الشعرية ومن هذه المورثات:

- مورثة Gus) glucoronidase - B) الذي يمكن الكشف عنها بسهولة في الجذور الشعرية باستخدام تقانة الدراسة التشريحية.

- مورثة ال Il NPT-Il) Gene Neomycin Phosphor Transferase) ويرتبط معه أنزيم Kanamyein resistant.

- مورثة GFP) Gene Green Fluorescent protein)

- المورثة التي تعطي المقاومة للمضاد الحيوي الهيجرومايسين Hygromycin ففي هذه الحالة يتم الكشف عن التعديل الوراثي في الجذور الشعرية.

تطبيقات زراعة الجذور الشعرية Hairy Root Culture Applications:

توجد تطبيقات متعددة لزراعة الجذور الشعرية، إذ تعد طريقة من طرائق التعديل الوراثي والنقل المورثي، كما يمكن بوساطة هذه التقانة دراسة آلية عمل المورثات وآلية اصطناع بعض المركبات الفعالة. ويعد إنتاج المواد الفعالة من أهم تطبيقات زراعة الجذور الشعرية. ويوضح الشكل (9) أهم تطبيقات تقانة زراعة الجذور المختلفة.

1- إنتاج مركبات ثانوية: Secondary Metabolites Production

ينتج النبات نوعين من المركبات:

- المركبات الأساسية: مثل الكربوهيدرات، الدهون، البروتينات. في مركبات يعمل النبات على إنتاجها لتأمين العناصر الأساسية اللازمة للانقسام الخلوي والنمو والتطور النباتي. وأي نقص في أي مركب يعمل على توقف النمو النباتي.

- المركبات الثانوية: وهي مركبات مهمة ينتجها النبات لأغراض محددة مثل:

- بعض المركبات التي تعمل على جذب الحشرات لإتمام عملية الإلقاح.

- بعض المركبات التي تعمل على المحافظة على حياة النباتات من الإجهادات الحيوية واللاحيوية مثل الفيتامينات الفلافونيدات، الأصبغة.

- بعض المركبات الفعالة مثل المضادات الحيوية وبعض المركبات الفعالة التي تدخل في صناعة الأدوية مثل القلويدات الزيوت العطرية، الأصبغة، النيكوتين، الهيوسيامين، التربينات، الأتروبين... إلخ.

1-1- مزايا زراعة الجذور الشعرية لإنتاج المركبات الثانوية:

تنتج العديد من النباتات الطبية والعطرية كثير من المواد الفعالة التي تراكمها في المجموع الجذري في الطبيعة. يتم الحصول على هذه المواد من خلال جمع النباتات من الطبيعة واستخلاص المواد من الجذور، وهذا يتطلب القضاء على النباتات التي تعيش في الطبيعة. إذا كان الطلب كبيراً على المواد الفعالة الموجودة في هذه النباتات البرية، ولا يوجد سياسة آمنة لحفظ قسم من النباتات البرية فهذا يؤدي إلى تدهور الكثير من النباتات البرية وانقراضها، مما يحدث خللاً في التنوع الحيوي البري لهذه النباتات. ولذلك يجب وضع خطة بترك جزء من النباتات البرية ولو 10-20 % من مجموع انتشارها في الطبيعة حتى تستمر في تكوين البذور والإكثار للمحافظة على التوازن الحيوي الطبيعي وتجنباً لانقراضها.

- يعد إنتاج المواد الفعالة من الجذور الشعرية في المختبر وسيلة فعالة في المحافظة على التنوع الحيوي الطبيعي وتجنب تدهور الأنواع البرية المهمة.

- يتم إنتاج المواد الفعالة من الجذور الشعرية بطريقة سريعة سهلة، بفترة زمنية قصيرة، وبشكل مستقر ومستمر، وباستخدام أوساط مغذية خالية من الهرمونات النباتية.

- يمكن أن تعطي الجذور الشعرية نسبة أعلى من المادة الفعالة بالمقارنة مع نسبتها في الجذور الطبيعية لبعض الأنواع النباتية.

- تعطي تقانة الجذور الشعرية آفاق لتحسين وزيادة إنتاج المادة الفعالة، وذلك من خلال انتخاب سلالات عالية الإنتاج، ومن خلال إدخال بعض الجينات التي تؤثر في اصطناع بعض الأنزيمات التي تؤثر في اصطناع بعض المركبات الثانوية وزيادة إنتاجيتها.

1-2- آلية تأثير الجينات المدخلة في تكوين المركبات الثانوية:

تؤثر المورثات المدخلة بفعل البكتريا Agrobacterium rhizogenes إلى تعديل وراثي في آلية الاصطناع الحيوي للمواد الفعالة Methabolic Engineering.

يوجد هناك آليتان تفسران تأثير المورثات المدخلة في الاصطناع الحيوي للمواد الفعالة في الجذور الشعرية:

آ- تعمل الجينات المدخلة في النبات إلى تنشيط تكوين بعض الأنزيمات غير الموجودة أصلاً في النبات. تعمل الأنزيمات الجديدة إلى إحداث تغييرات في إنتاج المواد الفعالة في الجذور الشعرية مما يؤدي إلى زيادة في إنتاجها.

مثال: في الجذور الشعرية لنبات الروبيا Rubia peregrine تم إدخال جين محفز لإنتاج أنزيم جديد غير موجود وهو Isochorismated syntheses الذي أدى إلى إحداث تغييرات في آلية إنتاج مادة الأنتراكينون Anthraquinone مما زاد في معدل تراكمها في الجذور Anthraquinone مما زاد ف الشعرية (1996 ,.Lodhi et al).

ب- تعمل الجينات المدخلة في النبات إلى تنشيط تكوين بعض الأنزيمات الموجودة مسبقاً في الجذور الشعرية إلى زيادة فاعلية إنتاج المواد الفعالة.

مثال: إدخال جين في الجذور الشعرية لنبات الداتورة Datura meter هذا الجين يعمل في اصطناع أنزيم في الجذور الشعرية وهو Putrescine N-methyl transferase  (PMT) وهو بالأصل موجود في نبات الداتورة. يعمل هذا الأنزيم في تنشيط إنتاج مادة التروبان Tropan alkolid ويزيد من تراكمها في الجذور الشعرية في الداتورة (Moyano et al., 2003).

1-3- العوامل المؤثرة في إنتاج المواد الفعالة:

تؤثر مجموعة كبيرة من العوامل في إنتاج المواد الفعالة في الجذور الشعرية، وقد تم التعرض إلى العديد من العوامل من خلال دراستنا للعوامل المؤثرة في نمو الجذور الشعرية وإكثارها، مثل الحرارة، الإضاءة، تركيب الأوساط المغذية السلالة البكتيرية، طبيعة الأجزاء النباتية المستخدمة طبيعة الوسط المغذي الهرمونات النباتية، عمر النبات الأم...إلخ. كل هذه العوامل تؤثر في إنتاج المواد الفعالة ومدى تراكمها في الجذور الشعرية. يختلف تأثير العوامل المذكورة من نبات إلى نبات آخر. ولا يمكن التعميم في التأثير، لأنه أحياناً في نبات يكون أحد العوامل إيجابي، ويكون تأثير نفس العامل سلبي في نبات آخر.

فقد تمت دراسة إنتاج بعض المركبات الفعالة من خلال التحكم بالشروط الجوية وتركيب الأوساط المغذية. فقد أمكن الحصول على أعلى معدل من إنتاج مادة السولاسودين Solasodine بالجذور الشعرية لنبات نوع البنجورة Solanum Khasianum بزراعة الجذور الشعرية في وسط مغذٍ يحوي 3% سكروز، CO21 %، وبالإضاءة بشدة 2000 lux بفترة ضوئية 14 hإضاءة + 10 hاظلام، وبدرجة حرارة 25 (Jacob and Malpathak, 2004).

1-4- الإنتاج التجاري لبعض المواد الفعالة:

في السنوات الأخيرة، تم الانتقال من مستوى إنتاج بعض المركبات الثانوية الصيدلانية من المخبر إلى شركات تجارية كبيرة، تعمل على الإنتاج التجاري في المفاعلات الحيوية كبيرة الحجم.

يوجد العديد من الشركات التجارية التي تعمل في إنتاج بعض المواد الفعالة بوساطة تقانة الجذور الشعرية ومن هذه الشركات:

- شركة Rhizoprot: شركة فرنسية تعمل في إنتاج بعض المواد الفعالة ذات القيمة الاقتصادية مثل بعض أنواع البروتينات (GFP)، الأنزيمات، الأمصال.

- شركة Rootec: شركة سويسرية يتم إنتاج العديد من المركبات الفعالة من أكثر من 20 نبات طبي، حيث تنتج بعض مضادات الأكسدة، الفلافونيدات، قلويدات، فيتامينات، ومضادات حيوية .... إلخ.

2- إنتاج مواد فعالة جديدة:

تستطيع الجذور الشعرية بسبب التعديل الوراثي أن تنتج مواد فعالة جديدة، لا يمكن أن ينتجها النبات الأم الغير معدل وراثياً. يعزى السبب في اكتساب صفات جديدة بسبب المورثات الجديدة التي تم نقلها إلى النبات بفعل البكتريا Agrobacterium rhizogene تتمكن الجذور الشعرية بفضل تغيرات تحدث على مستوى آليات إنتاج المواد الفعالة إلى التوصل إلى إنتاج مواد جديدة غير موجودة في النبات الطبي المزروع في الطبيعة.

مثال: في نبات السكونولاريا Scutellaria baicalensis، تم إنتاج نوع الغليكوزيدات المرتبطة مع الفلافونات، وهي مركبات جديدة غير موجودة في النبات الأم (Nishikawa&Ishimaru, 1997).

3- تغيير في الطبيعة الكيميائية للمركبات الثانوية:

تستطيع الجذور الشعرية بحكم التعديل الوراثي تغيير في آلية إنتاج المادة الفعالة وتؤدي إلى تغيير في تركيبها الكيميائي وكميتها في الجذور الشعرية، ففي نبات اللوتس يسبب التعديل الوراثي تغييراً في تكثيف التانينات وطبيعتها الكيميائية ونسبة تراكمها في الجذور الشعرية بالمقارنة مع النبات اللوتس الأم.

4- دراسة آلية عمل الجينات:

تسمح تقانة الجذور الشعرية بدراسة وظيفة الجينات وكيفية التحليل الجزيئي للمورثات، كما تسمح بفهم عمل الجينات بعد التعديل الوراثي، كما تسمح بفهم دقيق لعمل المورثات أثناء التعديل الوراثي وكيف يعبر عن نفسه مع إمكانية دراسة آليات الإنتاج البيوكيميائي للمواد الفعالة.

5- إنتاج بروتينات جديدة:

يعد إنتاج البروتينات العلاجية بوساطة الجذور الشعرية على نطاق تجاري له أهمية اقتصادية كبيرة. حيث تم الحصول على عدة بروتينات جديدة لها أهمية في مجال استثمار التقانات الحيوية النباتية في علاج الأمراض أو في زيادة مقاومة النباتات لبعض الأمراض أو الفيروسات.

فقد تمكن العلماء من إنتاج بعض البروتينات مثل مولدات الضد Antibodies في الجذور الشعرية لنبات التبغ المعدل وراثياً. وقد تم الحصول على IgG monoclonal antibodis بشكل مستمر وقد تم دراسة عدة عوامل أدت إلى زيادة تراكم البروتين المذكور في الجذور الشعرية لنبات التبغ (Wongsamuth and Doran1997).

كما تم إنتاج بروتينات تعطي مقاومة لبعض الإصابات الفيروسية في الجذور الشعرية لنبات العنب. يعد نقل مورثة أو أكثر مسؤولة عن إنتاج بروتين فيروسي إلى نبات العنب يؤدي إلى تكوين جذور شعرية تعمل على تكوين بروتين خاص يعطي صفة المقاومة ضد فيروس معين، هذا يؤدي إلى الحصول على جذور شعرية تحمل صفة المقاومة للفيروس. ويمكن نقل صفة المقاومة إلى النبات الكامل في حال تمكننا من تجديد الجذور الشعرية والحصول منها على نباتات كاملة.

6- تجديد نباتات كاملة من الجذور الشعرية:

سجل تجديد نباتات كاملة بدءاً من الجذور الشعرية في العديد من النباتات مثل الـ Catharanthus roseus يتم الحصول على نباتات كاملة بعدة طرائق للتجديد:

- تكوين البراعم مباشرة دون المرور بمرحلة الكالوس. Direct Organogenesis

- تكوين البراعم بشكل غير مباشر، بعد تكوين الكالوس . Indirect Organogenesis

- تكوين مباشر للأجنة الخضرية من الجذور الشعرية Direct Embryogenesis

- تكوين غير مباشر للأجنة الخضرية من الجذور الشعرية، بعد المرور بمرحلة الكالوس Indirect Embryogenesis.

بشكل عام يتم الحصول على نباتات كاملة مستقلة وراثياً بدءاً من الجذور الشعرية ولابد من توفير الشروط والأوساط المناسبة للحصول على عملية التجديد.

فقد تم الحصول على براعم جانبية ونباتات كاملة من نبات الكاترانتوس Catharanthus roseus من الجذور الشعرية عند زراعتها في وسط مغدٍ من الـ MS والمضاف له 31.1 ميكرومول من الـ BAP و 5.4 ميكرومول من NAA ووصل معدل التجديد الى أكثر من 80% (2004 ,.Choi et al).

7- تعد طريقة من طرائق الإكثار الخضري الدقيق:

تعد تقانة زراعة الجذور الشعرية طريقة من طرائق الإكثار الخضري الدقيق في حال تم التجديد مباشرة دون المرور بمرحلة الكالوس ففي هذه الحالة نحصل على نباتات مشابهة في تركيبها الوراثي للنبات الأم. ويمكن استثمارها في التكاثر الخضري بزراعة الأنسجة. كما يمكن تكوين الأجنة مباشرة من الجذور الشعرية والتي يمكن تطويرها فيما بعد لتكوين البذار الصناعي الذي يمكن استثماره في التكاثر الخضري الدقيق.

8- استخدام في مجال التحسين الوراثي:

تعد تقانة زراعة الجذور الشعرية طريقة فعالة في الحصول على نباتات معدلة وراثية وتحمل جينات جديدة، تجعل منها وسيلة فعالة في الحصول على نباتات تحمل صفات جديدة كمقاومة الأمراض والاجهادات البيئية. هذا ما يعطي لهذه التقانة لاستثمارها في مجال التحسين الوراثي للنباتات.

ونشير إلى أنه في الإكثار الخضري الدقيق لبعض الأشجار الخشبية من الصعب الحصول على تجذير النباتات المزروعة داخل الأنابيب أو تكون نسبة تجذيرها منخفضة مما يحد من استعمال تقانة الإكثار بالنسج لبعض الأنواع. ففي هذه الحالة يمكن أن تلعب تقانة الجذور الشعرية دوراً مهماً في تحسين إكثار هذه الأنواع، لأنه لا يوجد بعض التجارب التي أدت تقانة الجذور الشعرية إلى تحسين تجذير العينات داخل الأنابيب مما أدى إلى تحسين تقانة الإكثار وأعطى فرصة لإمكانية استخدام الإكثار الدقيق في الإنتاج لهذه الأنواع صعبة التجذير. وهذا تم الحصول عليه في إكثار بعض أشجار الفاكهة مثل الزيتون، الدراق، التفاح (Mcaffe et al., 1993).

9- وسيلة لمكافحة التلوث Tool for phytoremediation:

تعد تقانة زراعة الجذور الشعرية وسيلة من وسائل مكافحة التلوث بالطبيعة. وهذا ما نطلق عليه استخدام النباتات في مكافحة التلوث phytoremediation ويتم في هذه الحالة استخدام الجذور الشعرية في تخليص الأوساط من المعادن الثقيلة عن طريق وتثبيتها داخل الجذور وتخليص الماء أو التربة من المعادن الثقيلة مثل الرصاص، الكادميوم.

كما يمكن التخلص من الملوثات عن طريق تحليل الملوثات في الطبيعة، وتحويلها بفعل النظام الأنزيمي الموجود بالنبات أو بالجذور الشعرية من الشكل السام وتحويلها إلى مركبات سامة، وقد استطاع بعض الباحثين من التخلص من بعض الملوثات الموجودة في البيئة مثل الـ DDT، وبعض المضادات الحيوية، أو المبيدات العشبية عن طريق معاملتها مع الجذور الشعرية لبعض النباتات مثل نبات الشيكوري و Helianthus annus وال .(Guillon et al., 2006) Brassica napus.

فقد تم التخلص من بعض المركبات الفينولية، والمركبات العضوية السامة والعطرية عن طريق زراعة الجذور الشعرية لهذا النبات Armoracia lapathifolia حيث تملك الجذور الشعرية لهذا النبات تراكيز عالية من بعض الأنزيمات مثل البيروكسيداز Peroxidases التي تعمل على تفكيك الفينولات والمواد العضوية العطرية إلى مواد غير سامة في فترة زمنية قصيرة، ولهذا يمكن القول أن زراعة الجذور الشعرية وسيلة فعالة في التخلص من الملوثات في الماء والبيئة والتربة.

10- إنتاج المواد الفعالة في المفاعلات الحيوية Bioreactor technology:

تعد النباتات بشكل عام مصدراً مهماً جداً للكثير من المواد الفعالة المستخدمة في الصناعة الدوائية والتجميلية، تمثل المواد الفعالة المنتجة من النبات مصدراً هاماً آخر وليس لها أية آثار جانبية كونها طبيعية، بعكس المواد الفعالة المصنعة بالمصانع قد يكون لها آثار جانبية ضارة. لهذا يتجه العالم اليوم نحو استثمار النباتات بطرائق تقانات الحيوية المختلفة للحصول على المواد الفعالة من النباتات باستخدام المفاعلات الحيوية.

إن عملية نقل الأبحاث المثبتة من المخابر الصغيرة إلى المصانع الكبيرة تتطلب تطوير تقانات أخرى غير التقانات التي يتم الحصول منها على المواد الفعالة مثل تقانات المفاعلات الحيوية، وهي عبارة عن أجهزة بأبعاد مختلفة من 1 لتر إلى أكثر من 1000 لتر. يتم بوساطتها التحكم بالأوساط المغذية ومكوناتها والشروط الضرورية المناسبة لنمو العينات النباتية (خلايا نباتية، كالوس، نموات خضرية، جذور شعرية) ليصار إلى اصطناع المواد الفعالة ونمو وإكثار العينات النباتية لفترة زمنية طويلة نسبياً.

ويعد تطوير المفاعلات الحيوية المناسبة والملائمة لكل تقانة من تقانات إنتاج المواد الفعالة وتأمين الشروط المناسبة عامل هام وأساسي في نجاح استثمار التقانات على النطاق التجاري، مثل إنتاج المواد الفعالة على نطاق كبير بدءا من زراعة الجذور الشعرية

يهدف المفاعل الحيوي الخاص بالجذور الشعرية إلى تأمين الشروط المناسبة (حرارة، إضاءة، أوساط مغذية ... إلخ) لفترة زمنية طويلة بحيث يسمح الحصول على أكبر كمية ممكنة من نمو الجذور الشعرية وإكثارها مع المحافظة على حيويتها. وفي الوقت نفسه من أجل الحصول على أكبر كمية ممكنة من إنتاج المواد الفعالة ولفترة زمنية طويلة نسبياً.

ففي تجربة أجريت على نبات السالفيا Salvia officinalis، تمت زراعة الجذور الشعرية في مفاعل حيوي مناسب وتم مقارنة إنتاج المادة الفعالة rosmarinic acid مع نموات مكاثرة خضرياً ومزروعة أيضاً في مفاعل حيوي تبين أن الجذور الشعرية بعد حوالي 40 يوماً أنتجت المادة الفعالة روزمارينيك أسيد بنسبة عالية بلغت 18 ضعف النسبة التي تم إنتاجها بفعل النموات الخضرية خلال نفس الفترة. 2010 .Grezegorczyk et al).