يمكن في الحقيقة ادخال جينات بدائية وحقيقية النواة في البكتريا على حد سواء، ولكن الوسيلة المستخدمة في كل منهما تختلف عن الأخرى. ففي بدائية النواة، كما في البكتريا مثلا، بعد عزل قطعة الـ DNA المرغوب، وربطها بالناقل بواسطة انزيم قاطع مناسب، وتكوين جزيئة الناقل الهجينة، تدخل تلك الجزيئة الى مضيف ملائم بواسطة عملية التحول عادة (راجع الفصل التاسع) وتتم بوضع الخلايا النامية بشكل فعال للبكتريا المعنية كما في بكتريا القولون في محلول مخفف من كلوريد الكالسيوم calcium chloride في وسط محاط بالثلج، الذي يزيد نوعاً ما من قابلية خلايا البكتريا لأخذ الـ DNA الغريب (شكل 1). إن التعرض لكلوريد الكالسيوم CaCl2 يكون عادة نصف ساعة والتي بعدها يضاف الـ DNA إلى عالق البكتريا لمدة نصف ساعة. إن حضن هذا الوسط لمدة قصيرة يسمح للخلايا بأن تأخذ الـ DNA الغريب وتكوين الخلايا المتحولة .transformants

شكل (1) التحول البكتيري كيميائياً. معاملة الخلايا بأيونات الكالسيوم ممكن ان تجعل الخلايا مؤهلة لأخذ الـ DNA ربما يلتصق الـ DNA على سطح الخلية البكتيرية وبواسطة صدمة حرارية تحدث عملية دخول الـ DNA الغريب (تصميم المؤلف).

بعد ادخال جزيئات الناقل الهجينة الى خلايا العائل المستلمة لابد من الاشارة الى تحول نسبة صغيرة من الخلايا فقط ، أما الأخريات فتفشل في أخذ الـ DNA الغريب (البلازميد الجديد). وهنا انبثقت الحاجة لوجود بعض الطرق التي تمكننا من معرفة الخلايا التي قد تحولت فعلاً. ولهذا السبب، فان النواقل كما في البلازميدات المستخدمة في حشر الـ DNA يجب أن تحتوي على بعض الواسمات القابلة للكشف selectable markers كما في المقاومة لبعض المضادات الحياتية antibiotic resistance.

بعد عزل الجين المرغوب وربطه مع ناقل الكلونة المناسب وادخاله الى الخلية العائل بوسيلة ما، بقيت الخطوة الأخيرة وهي تهيئة الأجواء الملائمة لذلك الجين كي يعبر عن نفسه وينتج جزيئة البروتين المرغوبة. ولابد من معرفة أن الجين المكلون لا يتم التعبير عنه عادة في الخلية العائل بدون وجود تحويرات معينة تضمن تعبير ذلك الجين في الخلية العائل. ولكي يتم استنساخه، يجب أن يحتوي الجين الغريب المنحشر في الناقل الهجين على بروموتر لابد من تمييزه من قبل انزيم RNA polymerase العائل. أما ترجمة نسخة الـ mRNA، فتعتمد على وجود تسلسلات القائد leader sequences وعلى تحويرات الـ mRNA الملائمة لضمان ارتباطه بالرايبوسوم. وكما نوقش هذا سلفا (راجع الفصل الخامس)، تعد تلك العمليات المتنوعة في بدائية النواة مختلفة بشكل كبير عن الموجودة في حقيقية النواة. فعندما يتم ادخال الـ DNA الغريب في خلايا الكائنات بدائية النواة كما في البكتريا، لابد له من أن يجهز بالتسلسل القائد هنا وذلك للمساعدة في تخليق البروتينات في البكتريا. وفي النهاية، يجب أن تزال الانترونات من جينات حقيقية النواة وذلك لأن العائل البدائي النواة لايقص الانترونات بعد استنساخ الـ mRNA ، وبالتالي، لا يمكن للبروتين حقيقي النواة أن يكون فعالاً بدون أن يتم ازالة انتروناته قبل الترجمة.

تم التغلب على مشاكل تعبير الجينات الغريبة في الخلايا العائل بشكل كبير بمساعدة نواقل كلونة خاصة تدعى نواقل التعبير (expression vectors). عادة تشتق تلك النواقل من البلازميد pBR322 وتحتوي على اشارات بدء الاستنساخ والترجمة الضرورية. وتمتلك كذلك مواقع تقييد مفيدة لهذه التسلسلات بحيث يمكن للـ DNA الغريب أن ينحشر فيها. تحتوي بعض نواقل التعبير على أجزاء من أوبرون اللاكتوز ، (راجع الفصل السادس)، والذي يمكن أن ينظم وبكفاءة تعبير الجينات المكلونة بنفس أسلوب الأوبرون. أما فيما يتعلق بادخال الجينات حقيقية النواة في البكتريا، فمنذ بدايات علم الهندسة الوراثية، تحمس الكثير من الباحثين بعد أن نجحت بعض جينات بدائية النواة في التعبير في الخلايا البكتيرية وبعد اكتشاف صفة العمومية (universality) في الشفرة الوراثية حيث تعطي الشفرة الوراثية نفس الحامض الأميني سواء في بدائية أو في حقيقية النواة (راجع الفصل الخامس)، وحاولوا - لهذا السبب ادخال جينات حقيقية النواة في البكتريا بنفس الطريقة التي تستعمل في ادخال الجينات بدائية النواة أن ذاك، على أمل أن تنجح تلك الجينات في التعبير عن نفسها في تلك البكتريا، ولكن شيئا من هذا لم يحصل. واستمرت تلك المحاولات الفاشلة الى أن اكتشفت حقيقة الانترونات في الجينات حقيقية النواة دون تلك البدائية منها عموماً (راجع الفصل الثاني). وبما أنه لا يوجد في البكتريا نظام يمكن أن يزيل الانترونات ويربط الاكسونات مع بعضها (راجع الفصل الرابع)، لذا لابد من البحث عن طريقة تمكن الباحثين ازالة الانترونات الغير مرغوبة قبل ادخال الجين الحقيقي النواة في البكتريا.

في الكائنات الراقية، تستنسخ العديد من الجينات إلى mRNA فقط بأنواع خلوية متخصصة. وعلى سبيل المثال، توجد جزيئات الـ mRNA التي تشفر إلى بروتينات الكلوبين في الخلايا الشبكية reticulocytes فقط. وبالمثل، ينتج الـ mRNA الذي يشفر للألبومين، البروتين الأساسي في المصل، من خلايا الكبد فقط عند تخليق الألبومين. ويمكن كلونة تسلسلات الـ DNA المتخصصة التي تعبر لجزيئات الـ mRNA في الخلية المعنية وذلك عن طريق تخليق نسخ DNA لجزيئات الـ mRNA معزولة من ذلك النوع من الخلايا، ثم تحشر نسخ الـ DNA تلك في البلازميد أو في نوافل الكلونة الأخرى.

تدعى نسخ الـ DNA من جزيئات الـ mRNA بالـ DNA المكمل (cDNA) complementary DNA بالإضافة إلى تمثيله فقط التسلسلات المعبرة لجزيئات الـ mRNA في نوع الخلية المحدد، ولكن يفتقد الـ cDNA الانترونات الغير مشفرة noncoding introns الموجودة في تسلسلات جينوم الـ DNA. وهذا، فمن الممكن تحديد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين مباشرة من التسلسل النيوكليوتيدي للـ cDNA المطابق له. إن العديد من جينات الكائنات الراقية تعد كبيرة جداً ولا يمكن أن تحشر في البلازميدات ولا حتى عاثيات لامدا، بسبب انتروناتها الطويلة التي تتخلل اكسونات تلك الجينات. وهذا هو الذي حدا الباحثين في هذا المجال إلى تشييد cDNA للجينات المرغوب كلونتها (أنظر الفصل الحادي عشر).

مواضيع ذات صلة

كلونة النعجة دولي Cloning Dolly the sheep

أدوات نقل الـ DNA نواقل الكلونة (cloning vehicles)

أدوات كلونة الجين المتعاقبة

genetic engineering in industry

البصمة المعتمدة على التوابع الكروموسومية الدقيقة

البصمة المعتمدة على التغاير العددي في تنوعات التكرارات المترادفةVariable number of tandem repeat polymorphisms

أنواع الTypes of DNA) DNA)

التباين في اطوال قطع التقييد (RFLP) Restriction fragment length polymorphism

فصل الكروموسومات بالترحيل الكهربائي

دراسة تسلسل الDNA sequencing) DNA)

مجسات الحامض النووي (Nucleic acid probes)

Joining DNA Fragments