تعد كلونة الجين جزء لا يمكن الاستغناء عنه في أي تلاعب وراثي ويتضمن ارتباط قطعة الـ DNA المرغوبة بالجزيئة الناقلة vector molecule والتي تعمل على انتشار قطعة الـ DNA تلك في البكتريا. ويتميز كل نوع من تلك النواقل بصفات ربما لا توجد في النواقل الأخرى. ومن الجدير بالذكر أن لكل نوع من نواقل الكلونة فوائد معينة يتميز بها عن النواقل الأخرى. وعلى أية حال، تعد البلازميدات هي الجزيئات الأبسط عند التعامل معها. أما العاثيات البكتيرية والفايروسات الأخرى فيمكن أن تخزن بشكل ملائم ولفترات طويلة. أما الكوزميدات والكروموسومات الاصطناعية، فيمكن كلونة قطع أكبر من الـ DNA فيهما.

ومن الجدير بالذكر الى أن كل النواقل تشترك بعدة صفات عامة حيث تكون صغيرة نموذجياً، وعملية نقل الناقل الجيني من الخلية الواهبة الى الخلية المستلمة سهلة نسبيا، وتكون ذات تسلسلات DNA معروفة، وتحتوي على الأقل أصل تضاعفي واحد ويمكن أن تتضاعف في العائل الملائم حتى عند احتوائها للـ DNA الغريب. وأخيراً، تشفر تلك النواقل الى صفة مظهرية والتي يمكن أن تستخدم لتشخيص وجودها، كما يمكن تشخيص النواقل الأبوية (الغير حاوية على DNA غريب) من النواقل الهجينة (الحاوية على الـ DNA الغريب) أن أهم أنواع نواقل الكلونة تلك هي:

أ: نواقل البلازميدات: تمتلك البلازميدات خواص عديدة جعلها مفيدة بشكل استثنائي كنواقل كلونة cloning vehicles حيث توجد بعض البلازميدات بعدة نسخ multicopy ضمن البكتريا الواحدة ويمكن لها أن تتضاعف بشكل مستقل عن الـ DNA البكتيري. كما تم معرفة التسلسل الكامل للبلازميدات، ومن هنا عرفت أماكن تواجد مواقع شق إنزيمات التقييد restriction enzymes cleavage sites كما إن البلازميدات أصغر من كروموسوم العائل ولهذا فمن الممكن وبسهولة فصلها عن الأخير، كما يمكن للـ DNA المرغوب من أن يزال بسهولة بواسطة قطع البلازميد بواسطة إنزيم متخصص لموقع التقييد الذي حشرت فيه قطعة الـ DNA الأصلية.

تعتبر البلازميدات أول جزيئات قد تم استخدامها في عملية الكلونة. ويمكن عزلها وتنقيتها بسهولة، ويمكن اعادة تقديمها الى البكتريا بواسطة عملية التحول (راجع الفصل التاسع). تحمل البلازميدات عادة الجينات المقاومة للمضادات الحيوية، والتي تستخدم في تشخيص العوائل البكتيرية. ويسمى البلازميد الهجين (recombinant plasmid) الحاوي على الـ DNA الغريب بالكايميرا (chimera) وهو حيوان اغريقي أسطوري والذي له رأس أسد، وذنب تنين، وجسم ثور أكثر البلازميدات المستخدمة بشكل واسع هو pBR322. يمتلك البلازميد pBR322 الجينات المقاومة لكلا الامبسلين والتتراسايكلين والعديد من مواقع التقييد والموجودة لمرة واحدة فقط في البلازميد وتقع ضمن الجين المقاوم للمضاد الحيوي (شكل 1). يساعد هذا الترتيب في الكشف عن البلازميدات الهجينة بعد القيام بعملية التحول. وعلى سبيل المثال اذا انحشر الـ DNA الغريب في الجين المقاوم للأمبسيلين، سوف لا يكون البلازميد قادراً على منح المقاومة للأمبسيلين بعد ذلك الانحشار. وبهذه الطريقة، تحتوي المتحولات التي تفتقد المقاومة للأمبيسلين على بلازميد هجين "كايميري". وكما قد تمت الإشارة إليه مسبقاً (راجع الفصل التاسع)، لا يشفر DNA البلازميدات عادة لأي وظيفة أساسية، ويمكن للخلايا التي تفتقد البلازميدات أن تنقسم طبيعياً. وتوجد البلازميدات عادة بعدة نسخ ويمكن لها أن تشكل وسائل لتضخيم عدد أي جين يوجد بنسخة مفردة وذلك عندما ينغرس فيها. وعلى سبيل المثال، يمكن أن تؤدي عملية الغرس في البلازميد إلى تضخيم سريع للجينات الضرورية لإنجاز مقاومة عالية للمضادات الحيوية. إن فائدة ما ذكر أعلاه في الهندسة الوراثية هو أن أي جين محمول من قبل بلازميد صغير يوجد بأعداد كبيرة، وبهذه الطريقة، ربما تتكون أعداد كبيرة من الناتج البروتيني لهذا الجين. إن مثل هكذا بلازميدات توفر مركبات مثالية لحمل العديد من الجينات الضرورية لإنجاز مقاومة عالية للمضادات الحيوية مثلاً عند الحاجة.

شكل (1) : تركيب بلازميد pBR322 وكيفية غرس الجين المراد كلونته فيه (تصميم المؤلف).

إن معظم النواقل البلازميدية هي من نوع متعدد النسخ multicopy plasmids: وأقدمها هو الناقل pBR322 وهو واحد من أكثر النواقل البلازميدية المعروفة لأنه كما بينا يحمل جينات المقاومة لـ ampicillin والـ tetracycline والتي تعمل كواسمات لانتقاء وتشخيص للهجائن الحاوية على ذلك البلازميد بالاضافة الى احتوائه على مناطق متفردة لعدة إنزيمات قاطعة والمتوفرة لحشر قطع الـ DNA. وعلى سبيل المثال، دعنا نرى ماذا سيحصل عندما تحشر قطعة إنزيم PstI في موقع الإنزيم PstI في الناقل pBR322، والذي يقع ضمن جين مقاومة الأمبسلين ampicillin resistant gene، إن مثل هكذا انحشار سوف يحطم وظيفة الجين عادة وبالتالي سوف لا يخلق بروتين β-lactamase فعال بعد ذلك. ولهذا، يمكن أن يتم الكشف عن البلازميدات الهجينة بواسطة قابليتها على منح المقاومة للـ tetracycline وليس للـ ampicillin. أما بالنسبة للإنزيم HIBam تبق نفس العواقب، فإذا انحشرت قطعة الـ DNA الغريبة في موقع الإنزيم HIBam، سوف يحطم الانحشار الجين الذي يوفر المقاومة للـ tetracycline للعائل البكتيري. وبعد تحول العائل البكتيري بالبلازميد الهجين توضع البكتريا على وسط نمو يحتوي على الـ ampicillin. ويتم تنمية نسخة أخرى منها على وسط يحتوي على الـ tetracycline لاختبار حساسيتها لل tetracycline. وهذا يسهل الحصول على الجين قيد الدراسة وذلك من خلال التخلص من تلك البكتريا التي لا تمتلك بلازميد على الإطلاق أو تلك التي تحتوي على بلازميد أصيل دون إضافة.

ب- نواقل العاثيات البكتيرية. تمتلك العاثيات جزيئات DNA خطية يمكن للـ DNA أن ينحشر بها عبر عدة مواقع تقييد يتجمع الـ DNA الهجين بعدما يتقدم العاثي خلال دورته التحللية lytic cycle وينتج دقائق العاثي الناضجة mature phage particles. إن الفائدة الأساسية لنواقل العاثيات على نواقل البلازميدات هو قدرتها على نقل جزيئات DNA أطول، فعندما يتقبل البلازميد قطعة DNA يصل طولها إلى kb 9-6 ، يمكن للعاثي أن يتقبل قطعة DNA قد يصل طولها kb 20-9 .

يستخدم العاثي لامدا بشكل واسع في تجارب كلونة الجين، يخمج هذا العاثي بكتريا القولون، وله القابلية على أن يتخذ شكلين مميزين وهما الشكل الحال (lytic)، والشكل المتحلل (lysogenic) يتبادلان مع بعضهما البعض في دورة حياة الفايروس (راجع الفصل السادس). وعلى الرغم من قدرة المادة الوراثية للعاثي لامدا على أن يتخذ الشكل الدائري لأجل التضاعف والانحشار في كروموسوم بكتريا القولون، ولكن المادة الوراثية تكون خطية (شكل 2). ويوجد في طرفي تلك الجزيئة الخطية قطعة من 12 زوج قاعدي ذات نهايات متدلية (cohesive ends)، وتكون كل نهاية مكملة للنهاية الأخرى، تعرف هذه التسلسلات بتسلسلات كوز (cos sequences) ، وسميت بتلك التسمية بسبب وجود النهايات اللزجة (cohesive ends) لتلك التسلسلات. وحال دخول العاثي لامدا داخل بكتريا القولون، تلتحم تلك النهايتين مع بعضهما البعض بواسطة انزيمات العائل مكونة شكل دائرياً من جينوم العاثي لامدا. يمكن تعبئة جزيئات DNA بطول 37kb الى 52kb في رأس العاثي. ويمكن أحياناً لجزيئات DNA صغيرة أن تتعبئ في جينوم العاثي لامدا من دون تضرر التعبئة. ولأجل حشر جزيئات DNA أكبر، فمن الضروري ازالة بعض المادة الوراثية من جينوم العاثي. تمتلك المنطقة اليسرى لجينوم العاثي جينات ضرورية للبروتينات التركيبية وتمتلك المنطقة اليمنى الجينات الضرورية للتضاعف والتحلل.

أما المنطقة الوسطى، فهي ليس ضرورية لحياة العاثي ويمكن استبدالها بـ DNA غريب يصل طوله الى 23kb .وبما أن المنطقة الوسطى تمتلك جينات لانحشار العاثي واعادة ارتباطه، لذا لا يمكن لنواقل الاستبدال المشتقة من العاثي أن تنحشر في كروموسوم العاثي لتكون الحالة المتحلحلة.

شكل (2) المادة الوراثية في العاثي لامدا، والمتمثلة بجزيئة DNA خطية ذات تسلسلات كوز في كل نهاية وبعدما يقوم العاثي بحقن مادته الوراثية في العائل البكتيري، يتحول مادته الوراثية من الشكل الخطي الى الشكل الدائري تزدوج كلتا النهايتين اللزجتين وتلتحم مع بعضها بواسطة الانزيمات البكتيرية (تصميم المؤلف).

ان عملية تكوين جزيئة هجينة بين الـ DNA الغريب والعاثي لامدا هي أكثر تعقيداً من تلك الحاصلة في النواقل البلازميدية. فهي لاتقتصر على انحشار الـ DNA الغريب في وسط العاثي لتكوين جزيئة DNA هجينة خطية ذات نهايتين لزجتين. وانما يجب تعبئة تلك الجزيئة الهجينة في رأس العاثي بشكل كفوء وتكوين عاثي هجين له القدرة في خمج الخلايا البكتيرية ، وهنا تحتاج خلية بكتريا القولون العائل الى ما يعرف بالتعبئة الخارجية ( in vitro packaging) (شكل 3). وفي هذه التقنية، يخلط مزيج بروتينات العاثي لامدا مع DNA العاثي الهجين خارج جسم الكائن الحي لتكوين دقائق العاثي.

وعند خمج مزرعتين من بكتريا القولون كل مزرعة تحتوي على طفرة مختلفة عن المزرعة الأخرى لا تمكنها من توليد بروتينات لامدا الضرورية. كل من المزرعتين الطافرتين تفتقد لأحد البروتينات الضرورية لتكوين رأس العاثي ولهذا لا يمكن لها تكوين رأس العاثي المتضمن للـ DNA في داخله. ولكن خلط كلتا مستخلصي المزرعتين يتكفل بتوفير كل بروتينات الرأس الضرورية وعند خلطها مع DNA العاثي الهجين يمكن لها أن تعطي العاثي الهجين القادر على خمج خلايا جديدة لبكتريا القولون (شكل 3).

استخدمت هذه العاثيات المزدوجة الشريط غالباً في توليد المكاتب الجينومية. أما العاثيات مفردة الشريط (كما في العاثي M13) فقد تم استخدامها في معرفة تسلسل الـ DNA (أنظر الفصل الحادي عشر).

شكل (3): التعبئة الخارجية (in vitro packaging) لنواقل الاستبدال للعاثي لامدا. يجب أن يتم تعبئة ناقل الكلونة لامدا المحتوي على الـ DNA المكلون في رأس العاثي قبل أن يخمج بكتريا القولون وقبل تعبئة الـ DNA، يجب عزل بروتينات رأس العاثي التي تتكفل بذلك. وللقيام بهذا ، تم خمج بكتريا القولون بالعاثي لامدا الطافر والذي يفتقد للجين الذي يشفر عن بروتين الرأس E. ثم تم خمج بكتريا القولون بطافر لامدا من نوع آخر، والذي يفتقد بروتين رأس العاثي D.ثم تم تنمية كلتا المزرعتين مع لامدا الهجينة، وتم حث الفايروسات كي تدخل في الدورة التحللية. ولو أن البكتريا قد حللت من قبل العاثي، الا أنها لا يمكن لها أن تكون رؤوساً كاملة. وبدلاً من ذلك، يعزل مزيج بروتينات العاثي. يحتوي كل مزيج على ذيول العاثي، بروتينات التعبئة، ومكونات الرأس، ماعدا البروتين D أو E. يخلط هذين المزيجين مع الناقل لامدا المحتوي على الـ DNA الغريب وعلى الرغم من حدوث عملية الخلط خارج جسم الكائن الحي، يمكن لتلك المكونات أن تتراكب ذاتياً لتكون عاثي وظيفي يمكنه أن يخمج بكتريا القولون (تصميم المؤلف).

ج: الكوزميدات .Cosmids الكوزميدات هي بلازميدات متعددة النسخ تحتوي مواقع cos المشتقة من العاثي لامدا ويمكن تعبئتها في رؤوس العاثي)شكل (A. 4 يحتوي جينوم العاثي لامدا على تسلسل تمييز (recognition sequence)  تدعى بالموقع cos أو النهاية اللزجة (cohesive end) وعندما يتعبأ الجينوم في رأس العاثي، ينشق في موقع Cos واحد وينحشر الـ DNA في رأس العاثي الى أن يدخل موقع cos الثاني. وبهذه الطريقة، يتعبأ أي DNA محشور بين مواقع Cos في رأس العاثي. ويمكن يحتوي الكوزميد على عدة مواقع تقييد وعلى عدة جينات مقاومة للمضادات الحيوية.

شكل (4). كيفية استخدام الكوزميدات في عملية الكلونة (A) تركيب الكوزميد، يحتوي الكوزميد على مواقع cos المشتقة من العاثي لامدا وعلى أصل التضاعف وجين المقاومة لأحد المضادات الحيوية مشتقة من البلازميد. (B) آلية كلونة الـ DNA في الكوزميدات. لكلونة قطع كبيرة من الـ DNA الى نواقل الكوزميد، يجب أن تكون كلتا الـ DNA والنواقل ذات نهايات لزجة. يتم أولاً تحويل النواقل الى الشكل الخطي بحيث يحتوي على موقع. cos ثم يتم قطع الكوزميد بالانزيم القاطع. ويتم قطع DNA الجينوم من المصدر المرغوب أيضاً. تم تقطيع DNA الجينوم بنفس الانزيم القاطع أو بانزيم قاطع يولد نفس النهايات. تخلط هذه القطع مع نصفي الكوزميد وتربط باستخدام انزیم  DNA ligaseتعبئ الجزيئة الهجينة النهائية في رؤوس العاثي خارج جسم الكائن الحي وتستخدم بعدها في خمج بكتريا القولون (تصميم المؤلف).

ان الاحتياج الوحيد لتعبئة الـ DNA خارجياً في العاثي لامدا هو وجود موقعين من مواقع cos مفصولة بـ 37-51kp من التسلسلات المتخللة. وعلى هذا الاساس تم تطوير الكوزميدات. وبعد حدوث تفاعل التعبئة ، تستخدم دقائق العاثي لامدا المتكونة حديثاً لتخمج خلايا بكتريا القولون. يقوم العاثي بحقن الـ DNA في البكتريا وكأنه DNA طبيعي ويتم تدويره خلال تكامله مع نهايات مواقع cos .لكن حفظ الـ DNA المتدور في خلايا بكتريا القولون يكون على شكل بلازميد ولهذا السبب، فان انتقاء الخلايا المتحولة يكون على أساس المقاومة للمضادات الحيوية، حيث أن المستعمرات البكتيرية المتحولة (بدلاً من البقع plaques المكونة في حالة العاثي لامدا) سوف تحتوي على الكوزميد الحاوي على الجين الغريب. وبما أن دقائق العاثي لامدا يمكن أن تتقبل مابين 37-51kp من الـ DNA، ومعظم الكوزميدات تكون بطول 5kp في الحجم فقط، لذا، يمكن كلونة 32-47kp من الـ DNA في هذه النواقل. وهذا يمثل كمية DNA أكبر من تلك التي تقبلها الناقل لامدا نفسه. لذا، عند استعمال كوزميد صغير، ولنقل بطول 4kb، يمكن بهذه الطريقة حشر قطعة DNA بأكثر من 45kb طولا. ان الكوزميدات، كما هو الحال في البلازميدات، تكون مستقرة جدا، ولكن حشر قطع DNA كبيرة يمكن أن يعني صعوبة الحفاظ على الكوزميدات الناتجة في الخلية البكتيرية ولابد من ملاحظة أن الصعوبة الأساسية الكامنة من وراء التعقيد في التعامل مع الكوزميدات تتمثل بانتاج قطع DNA خطية ملتحمة والتي يكون فيها الكوزميد والجين المنحشر فيه يصنعان تسلسلات متكررة (concatameres) مع بعضها البعض (شكل 5B-)

تستخدم نواقل العاثيات لامدا أو الكوزميدات في بناء المكاتب الجينية عموماً، مكتبة الـ DNA، هي مجموعة من قطع الـ DNA المكلونة في ناقل كلونة ممكن أن يستخدم في البحث عن قطعة الـ DNA المرغوبة. وهنالك نوعين من تلك المكاتب تستخدمان في الحصول على قطعة الـ DNA المرغوبة. يدعى النوع الأول بمكاتب الدنا الجينومية ((genomic DNA libraries وتصنع تلك المكتبة من جينوم الكائن المعني. وعلى سبيل المثال، تصنع مكتبة الفأر الجينومية بواسطة هضم DNA الفأر النووي هضما جزئياً بالأنزيم القاطع لانتاج عدد كبير من قطع DNA مختلفة ولكن كلها تمتلك نهايات لزجة متماثلة (أنظر أدناه). وبعد ذلك، يتم لحم قطع الـ DNA بالنواقل المشتقة من العاثيات لامدا أو بنواقل الكوزميدات المقطوعتين بنفس الانزيم القاطع. تحتوي هذه المكتبة على كل تسلسلات الـ DNA النووية للفأر ويمكن البحث فيها عن أي جين مرغوب في الفأر. هذا وليس كل نسيلة سوف تحتوي على جين كامل لأنه - وفي العديد من الحالات - تقوم الانزيمات القاطعة بعمل قطوعاتها ضمن الجين. وهكذا، سوف تحتوي بعض النسائل على جزء من جين بدلا من جين كامل. أما النوع الثاني من مكاتب الـ DNA فتدعى بمكاتب الدنا المكمل (cDNA libraries). ويتم صنع مكتبة الـ cDNA بواسطة استخدام انزيم reverse transcriptase المشتق من الفايروسات الارتكاسية (retroviruses) (أنظر أدناه).

د - الكروموسومات الاصطناعية artificial chromosomes. بالاضافة الى الأنواع الثلاث الرئيسية من النواقل وهي البلازميدات والعاثيات البكتيرية، والكوزميدات cosmids، تعد الكروموسومات الاصطناعية artificial chromosomes نوعاً رابعاً مهما لنواقل الكلونة. تعد الكروموسومات الاصطناعية وسيلة شائعة في النقل الجيني لأنها تحمل كميات كبيرة من المادة الوراثية. ويعد كروموسوم الخمائر الاصطناعي ( yeast artificial chromosome) أو YAC واحداً من أوسع الكروموسومات الاصطناعية استخداما ان الـ YACs هي امتدادات DNA تحتوي على كل العناصر الضرورية لانتشار الكروموسوم في الخمائر، وهي أصل التضاعف والسنترومير والتيلومير (راجع الفصل الثاني). وتمتلك كذلك مواقع لانزيمات التقييد وواسمات وراثية بحيث يمكن أن يتم تعقبها وانتقائها. ينشق الـ YAC بانزيم تقييد ملائم، والذي يفتحه ويسمح بانحشار قطعة من الـ DNA الغريب بين السنترومير والتيلومير. وبهذه الطريقة، تحتوي الـ YACs على قطع DNA بين 100Kb و 200Kb في الحجم ويمكن أن توضع في خلايا خميرة cerevisiae Saccharomycesويمكن له أن يتضاعف بجانب الكروموسومات الحقيقية. أما الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) هو ناقل كلونة بديل يزداد استخدامه شيوعاً. تعد الـ BACs نواقل كلونة معتمدة على بلازميد الخصوبة في بكتريا القولون (راجع بلازميدات الخصوبة في الفصل التاسع). وتحتوي على مواقع ملائمة لانزيمات التقييد وواسم كما في المقاومة للكلورومفنيكول. ينشق البلازميد المحور في موقع التقييد، ويتم ربط قطعة الـ DNA الغريب والتي يبلغ طولها أكثر من 300Kb باستخدام الانزيم اللاحم DNA ligase . يتكاثر الـ BAC في بكتريا القولون بعد عملية ادخاله بواسطة جهاز مولد الصدمات الكهربائية أو electroporator. ويمكن لهذا الناقل أن يتكاثر ويتحور بسهولة ولا يعاني اعادة ارتاباط كما هو ملاحظ في الـ YACs. يمتلك عدم حدوث عملية اعادة الارتباط فائدة تكمن في أن الـ DNA المنحشر لا يمكن عادة أن يحدث فيه اعادة ترتيب بحيث يحافظ على تسلسله كما هو. وبما أن نواقل الـ BACs يمكن لها أن تحمل قطع كبيرة من الـ DNA، تعد الكروموسومات الاصطناعية مهمة بالتحديد في معرفة تسلسل الجينوم.

مواضيع ذات صلة

كلونة النعجة دولي Cloning Dolly the sheep

ادخال الجينات في الخلايا البدائية النواة

أدوات كلونة الجين المتعاقبة

genetic engineering in industry

البصمة المعتمدة على التوابع الكروموسومية الدقيقة

البصمة المعتمدة على التغاير العددي في تنوعات التكرارات المترادفةVariable number of tandem repeat polymorphisms

أنواع الTypes of DNA) DNA)

التباين في اطوال قطع التقييد (RFLP) Restriction fragment length polymorphism

فصل الكروموسومات بالترحيل الكهربائي

دراسة تسلسل الDNA sequencing) DNA)

مجسات الحامض النووي (Nucleic acid probes)

Joining DNA Fragments