التبوغ Sporulation

عادة ما يلاحظ ان الخلايا تكون مزودة بوسائل للشعور بما يحيط بها من الظروف. فمثلا البكتريا المكونة للأبواغ وعند ازدحام الخلايا ونقص المواد الغذائية وزيادة الفضلات في محيط الخلايا النامية في أوساط مختبرية، فهذه الظروف غير ملائمة تؤدي الى حث الطفرات لمواجهة الاخطار والتي تختفي معظمها عند عودة الظروف الى الحالة الطبيعية وزوال الاجهادات او الكروب Stresses ، اما الخلايا المكونة للأبواغ فتحت مثل هذه الظروف تبدأ بعملية التبوغ وتكوين الابواغ المقاومة لمختلف الظروف غير الملائمة وتبقى سابتة لمدة طويلة تصل الى ملايين السنين للحفاظ على النوع وتعود للإنبات عند ملائمة الظروف وتختلف الاحياء المجهرية في التصرفات للوصول الى حالة السبات وتكوين الابواغ ومنها جنس Bacillus الهوائي وجنس Clostridium اللاهوائي كذلك جنس Sporolactobacillus من بكتريا حامض اللاكتيك وكذلك بكتريا Sporosarcinia من المكورات، تدخل مرحلة التبوغ التي يتم ايضاحها في الآتي.

عملية التبوغ هي عملية هروب للخلايا من الظروف غير الملائمة، وهي بمثابة عملية تمايز وتخصص في البكتريا التي تظهر فيها الخلايا بشكلين مختلفة، فالبوغ لا يحتاج الى التغذية ويكون مقاوما للظروف غير الملائمة وذلك لان الخلايا بشكلها الهاجع تكون مقاومة للجفاف والحرارة والعوامل الكيماوية وغيرها. وعملية التبوغ عملية معقدة جدا وتشارك فيها العديد من الجينات التي تنتج العديد من الانزيمات والمتأيضات الاخرى، تبدأ عند نهاية الطور اللوغاريتمي وترافقها اختفاء مستلزمات الخلايا الخضرية التي تعطل. وتعود التغيرات في الفعاليات الحيوية للخلايا التي هي في حالة تكوين البوغ الى الاختلافات في الفعاليات الانتساخية للأنزيم RNAP نتيجة ارتباطه بعدد من البروتينات الخاصة هي عوامل سيكما Sigma factors الذي ينتج منها أنواع تختلف في الطور الخضري عما ينتج في طور التبوغ. وفي النموذج الدراسي لهذه العملية وهي بكتريا B. subtilis تستمر العملية 6 -7 ساعات تحت الظروف المختبرية. وقد أمكن تمييزها الى عدة مراحل تحصل فيها تغيرات شكلية ظاهرية على الخلايا والبعض من الانواع ينتج المضادات الحيوية أثناء العملية والتي تلعب دورا مهما في تنظيم التبوغ.

متطلبات التبوغ :

تبدأ عملية التبوغ عند وجود بعض الظروف التي تتعرض لها الخلايا ومنها

•    ان تكون الخلايا في طور الاستقرار.

•  ان تكون بكثافة عالية لغرض افراز بعض المواد ومنها عامل التمايز الخارجي EDF – 1 (Extracellular differentiation factor -1) وهو بيبتيد صغير يرتبط بالخلايا الجائعة لغرض اعطاء اشارة بدا التبوغ.

•        ان تكون الخلايا جائعة بالنسبة للمواد الغذائية المهمة مثل مصادر الكاربون والنتروجين والفسفور سوية أو اي منهم.

والاشارة الداخلية في الخلايا يعتقد انها مركبات GTP و GDP التي تكون ppGpp و pppGpp

{3'-diphosphate-5'-diphosphate ( ppGpp) ,Triphosphate-5'-diphosphate (pppGpp)}

وهي ما يطلق عليها أحياناً المنذرات Alarmons وعرفت في الاستجابة للمجاعة او الصوم (التي سيأتي ذكرها لاحقا). وعند بدا عملية التبوغ تنقسم الخلايا بشكل غير متناظر كما موضح في الشكل (1).

الجزء الصغير هو البوغ الأول Prespore والجزء الكبير هو الخلية الام. وتكون عملية التبوغ عملية معتمدة على الوقت، والتي يتم فيها التعبير عن جينات جديدة في كل من الخلية الام والبوغ الأول على مراحل زمنية متعاقبة وهذا يشير الى ان العملية تنظم بعملية الانتساخ.

والمعروف ان انزيم الانتساخ RNAP مكون من مجموعة من الوحدات الفرعية α β β' δ  والعامل سيكما يتيح للأنزيم تميز الممهدات المراد قراءتها في DNA وانتساخها. فجينات الطور الخضري تقرأ بمساعدة δ^A كعامل تميز وعند ارتباطه يعرف الانزيم E δ^A . اما عند التبوغ فيظهر عامل سيكما جديد هو δ^H وهو خاص بأول مجموعة من جينات التبوغ، وتنشط اشارات التبوغ بأنظمة الفسفرة الحاوية على مجموعة من المتحسسات والناقلات Transmitter protein kinases التي يفسفر احدها البروتين SpoOA، والاخير بعد فسفرته يمكنه الارتباط بالـ DNA لذلك يطلق عليه منظم الاستجابة لأنه ينظم قراءة DNA استجابة لإشارات خارجية.

ويقوم Eδ ^H و SpoOA بقراءة الجينات الأولى من اوبرون التبوغ، وتكون نتيجة القراءة انتاج اثنين من عوامل سيكما جديدة δ^E و δ^F (وهذه عند اكتمال عملية التبوغ وتكوين الحاجز العرضي بين الخلية الام والبوغ الاول فالـ  δ^E يذهب الى الخلية الام واما  δ^F  فيذهب الى البوغ ). وبما ان البوغ الاول والخلية الام  تحوي على عوامل سيكما مختلفة فانها تؤدي الى ازالة الكبح عن مجموعة مختلفة من الاوبرونات أو المنظمات (Regulons)، لذلك فان مصير الجزئين سيختلف، فالجينات المبكرة في البوغ تقرأ بالعامل δ^F وتظهر في البوغ عوامل اخرى مثل δ^G الذي يؤدي الى تغير الفعاليات الايضية فيه. اما الخلية الام فان فعالياتها تنظم بواسطة 4 من الجينات التي يتم قراءتها بعد تكون الحاجز وتتم السيطرة عليها δ^E .

وأثناء عملية الابتلاع للبوغ الأول من قبل الخلية الام كما موضحة في الشكل، يتم تشغيل او ازالة الكبح عن اوبرونات جديدة تعمل تحت سيطرة كل من δ^E و SpoIII D والذي هو بروتين يمكنه الارتباط بـ DNA ، وهذه الاوبرونات تساهم في الخطوات القادمة فتكون القشرة الأولى يكون تحت سيطرة δ^E والبروتين SpoIII D . والخطوات التي تلي ذلك وهي تكون كامل للقشرة والنضج وتكون الاغلفة الخارجية فتتم بمساعدة منتجات جينات من اوبرونات تكون تحت سيطرة العامل δ^K وبروتينات اخرى ترتبط بـ DNA وتعرف بـ Ger E proteins.

 شكل 1 : عملية التبوغ في الاحياء المكونة للأبواغ (جنس Bacillus) 

وكحصيلة فان هنالك أكثر من 50 اوبرون يزال الكبح عنها بالتتالي اضافة الى ان بعض الاوبرونات تشفر لأنزيمات متعددة او بروتينات تركيبية وتشمل (Sporulation) spo واوبرونات الانبات (Germination) ger وكذلك تنتج انزيمات تخليق الجدار الخلوي اضافة الى اوبرونات اخرى تعمل بتناسق وتعاون مع الاحداث المذكورة وبالرغم من ان الاوبرون ger سمي بهذا لأنه يشارك في عملية الانبات الا ان العديد من انزيماته تلعب دورا مهما في تكوين البوغ الداخلي.

وباختصار فان السبب في سير الخلية الام والبوغ الأول في طريقين مختلفين يعود الى الاختلاف في عوامل سيكما، فالبوغ تقرا معلوماته بمساعدة δ^F و δ^G ويتحول الى شكل سابت. اما الخلية الام فتقرا المعلومات فيها بمساعدة δ^E و δ^K تحت تأثير البروتينات SpoIII D و Ger E وتقوم بتكوين جدار لحماية البوغ من الظروف الخارجية.

واثناء عملية التبوغ فهناك سلسلة من الاحداث والاشارات تكون مرتبة جزيئيا لحدوث الاستجابة من اشارات تنتج من الخلية الام الى البوغ الأول وبالعكس، وهذا التواصل بينهما يضمن حدوث الاحداث بشكل متناسق ومنضبط.

وبعد انتهاء احداث تكوين البوغ فان البوغ الناتج يتصف بأنه :

1.       يحوي على الكروموسوم الكامل للخلية وكذلك يحوي على الانزيمات اللازمة لتخليق بعض البروتينات، ونظام توليد الطاقة الذي يعتمد اساسا على تحلل السكر Glycolysis (أي بدون فسفرة تأكسدية) وذلك لأنه لا يحوي على السايتوكرومات حتى في الاحياء الهوائية وفي حالة الاعتماد على مسارات نقل الالكترونات فانها تكون مختصرة ومكونة من البروتينات الفلافونية (Flavoprotein) . ويحوي البوغ أيضاً على كميات كبيرة من انزيمات الطور الخضري مثل Alanine racemase ، كما يحوي كميات كبيرة من بعض الانزيمات الخاصة مثل Dipicolic acid synthetase وتعود مقاومة البوغ الى حالة الجفاف التي يعانيها وكذلك لوجود مركب Ca-dipicolinate التي تشكل 5 – 15% من وزن البوغ الجاف وتتكون من المركبات الوسطية لمسار تخليق اللايسين اثناء عملية التبوغ.

2.       اما جدار البوغ فالطبقة الداخلية وهي جدار البوغ فتحتوي على الببتيدوكلايكان الطبيعي والتي ستصبح الجدار الخلوي للخلايا النابتة بعد عملية الانبات.

3.       يحوي القشرة وتمثل اسمك الطبقات التي تحيط بالبوغ وتحوي على الببتيدوكلايكان غير طبيعي اذ يحوي على اتصالات عرضية اقل من الموجودة في الجدار الخلوي ويكون حساس جدا لأنزيم اللايسوزايم Lysozyme وعملية تحلله تلعب دورا مهما في انبات البوغ، وينظم بفعالية E δ^K .

4.       الغلاف Coat ويتكون من بروتين يشبه الكيراتين Keratin يحوي العديد من الاتصالات ثنائية الكبريتيد بين الجزيئات وتكون الطبقة غير ناضجة واليها تعزى مقاومة البوغ للمضادات الحيوية والكيماوية وتنظم بـ E δ^K.

5.       العلبة الخارجية Exosporium وتكون بمثابة غشاء يحوي البروتينات الدهنية الحاوية على بعض الكاربوهيدرات.

ان اطلاق البوغ الداخلي Endospore من تركيب الخلية الام تشارك فيها انواع من المحللات الذاتية Autolysins ، ينتج بعضها في نهاية الطور اللوغاريتمي او في نهاية عملية التبوغ منها Cw1C الذي ينتج في نهاية عملية التبوغ مع محللات تحتاج الى نواتج او بروتينات Ger E للتعبير عنها والاخير هو المسئول عن تنشيط عمليات انتساخ بروتينات الغلاف وكذلك يقوم بتنظيم التعبير عن δ^K الذي يعد المنظم الاخير لمسار معقد يبدأ بـ SpoOA كما مر ذكر اعلاه.

وعملية التحلل الحاصلة لا تتم باستعمال المحللات الذاتية لوحدها وانما تحتاج الى عوامل منشطة، فبعد تكوين البوغ ينطلق عامل خاص يستهدف الخلية لام ويقوم بتحليلها، وعملية التحلل هذه تعرض البوغ الى الظروف الخارجية، كما ان عملية التحلل تؤدي الى اطلاق المواد التي تساعد الخلايا المتبقية التي هي في طور التبوغ وتزويدها بالطاقة لإكمال عملية التبوغ. وتزداد عملية تحلل الخلية الام عند نقل المزروع الى وسط فقير بمصادر الكاربون، والحقيقة ان عملية التحلل تنشط عند نقصان pmf وليس نقصان ATP.

انبات البوغ

وهي عملية أسرع من عملية التبوغ فهي تتم في مدة حوالي 90 دقيقة والسبب في اختلاف الوقت هو ان عملية الانبات هي ليست عملية عكسية للتبوغ. ومعظم الابواغ الناتجة لا يمكنها الانبات مباشرة ولكنها تستطيع ذلك بعد عدة ايام، وعند ملائمة الظروف مثل تزويدها بالمواد الغذائية او تنشيطها بأحد العوامل التي تدمر غلاف البوغ، ومن العوامل التي يمكن ان تتغلب على حالة سبات البوغ هي الحرارة والحك او الحموضة والمواد الحاوية على مجاميع من السلفاهيدريل (- SH).

ويمكن ان تقسم عملية انبات البوغ الى عدة مراحل :

المرحلة الأولى : وهي التنشيط باستعمال بعض المنشطات المذكورة اعلاه وأهمها الحرارة او المواد الكيماوية، وعند تحفيز مستلم الالنين اليساري الذي هو احد البروتيزات او غيرها. ومعظم الانواع المنتجة للأبواغ طورت مستلمات للتميز بين مختلف المنفذات مثل وجودها في وسط غذائي غني، فالبعض يحفز بالالنين واخر يقدح بالادينوسين واخر يقدح بالكلوكوز وغيرها من المواد.

المرحلة الثانية : بعد ارتباط المستلم بالمنفذات (Effectors) يؤدي الى تنشيط المحللات التي تؤدي الى تفكيك الببتيدوكلايكان في القشرة، وقبط الماء وتنطلق Ca- dipicolinate وأثناء هذه المرحلة يفقد البوغ خاصيته في المقاومة وعصيانه ويصبح نشطا من الناحية الايضية وتفكك عددا من مكونات البوغ الخارجية بالأنزيمات الحالة وتصبح عملية الانبات غير قابلة للرجوع.

المرحلة الثالثة : وهي مرحلة النمو الخارجي للبوغ وهي التي تعيد البوغ الى الطور الخضري فبعد تفكك القشرة والطبقات الخارجية يؤدي ذلك الى بزوغ خلية خضرية جديدة مكونة من جبيلة البوغ (Spore protoplast) ثم تحصل عمليات تخليق للبروتينات ومكونات الخلية الاخرى بشكل نشط جدا ينتهي بانقسام الخلية وهذا يحتاج الى تزويد الخلايا بكل المواد اللازمة لنموها.

والابواغ بالرغم من انها سابتة الا انها تحوي عددا من الانزيمات التي تبدا بالعمل على مواد الاساس لها بعد وقت قصير من حث عملة الانبات. ومن المواد الاساس المهمة في الابواغ السابتة هي 3-phosphoglycerate التي يتم هدمها اثناء الدقائق الأولى لعملية الانبات لانتاج الطاقة ATP.

ولذلك يلاحظ ان عمليات الانبات تتميز بكونها عمليات هدم وتفكيك في المراحل الأولى ويتم فيها اطلاق الايونات الموجبة والحامض DPA ويتشرب البوغ بالماء وتحلل القشرة. اما عمليات التخليق الحيوي فتتمثل بعمليات النمو الخارجي الذي يؤدي الى انفلات البوغ من الغلاف Coat ويليها نمو وانقسام الخلايا.

اما الابتدائيات فعند تعرضها لظروفها قاسية فانها تعاني حالة التكيس Encystment وتكون الاكياس Cysts السابتة، وتكون الاكياس ذات نمط تركيبي معين فتكون الطبقات الخارجية الحاوية على بروتينات غير ذائبة في الحوامض. اما الطبقة الداخلية Endocyst مكونة من السيليلوز ولا تذوب في القلويات. وتكون مقاومة للمواد القاتلة خاصة بعد تكون الجدار السليلوزي وذلك لكونه يشكل حاجزا فيزياوي ويكون مسئولا عن قلة الحساسية. وتكون الاكياس في حالة سبات من الناحية الايضية.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .