الهندســـة الوراثيـــــة

اول عمليات الهندسة الوراثية الطبيعية التي لوحظت هو انتقال T-DNA مــــــــــــــن البكتريا Ag. tumefaciens الى النباتات متخطية ليس الانواع وإنما ممالك الحياة. وتعد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية ضمن النشاطات البشرية بمثابة توائم سيامية لا يمكن ان يفترقا فالهندسة الوراثية هي التي كانت المحرك الأساسي في وجود التقنيات الحيوية الجديدة، كما ان الاخيرة هي المجال التي تجد الهندسة الوراثية المجال الاوسع للتطبيق. فعمليات التصنيع الحيوي هي المحك لاستعمال الاحياء المحورة، لذلك يلاحظ ان المجالات المهمة هي التي نشطت فيها دراسات الهندسة الوراثية وتأتي الجوانب الطبية والبيئية في المقدمة ثم تليها الجوانب الاخرى.

وتعمد الهندسة الوراثية الى تحوير وتغير المواد الوراثية التي يترتب عليها تغير أداء الاحياء عند انتقالها لمرحلة التعبير المظهري، وأغلب العمليات تهدف الى ادخال جينات ذات صفات مرغوبة في احياء مضيفة يفضل ان تكون معروفة الخلفية الوراثية لتشكل مجالا لحدس التغيرات المتوقعة وكذلك تسهل متابعة التعبير الجيني في تحديد النمط المظهري للخلايا الناتجة. وتشمل عملية كلونة الجينات Gene cloning (الهندسة الوراثية) خطوت رئيسة هي :

1-      الحصول على الجينات المرغوبة التي يمكن ان تحضر بأكثر من طريقة ولكن الانزيمية هي المفضلة.

2-      ربط القطع المطلوبة الى متضاعفات او نواقل ملائمة لإنتاج الناقل المهجن Hybrid replicon او Hybrid vector ويسمى أيضاً Chimeric vector.

3-      استعمال خلايا مضيفة لتكثير النواقل الهجينة قبل الاستعمال وأغلب الأحيان تكون بكتريا E. coli نظراً لمعرفة الخلفية الوراثية لهذه البكتريا ولكونها كائن سريع النمو ولسهولة التعامل معها.

4-      ادخال النواقل المحملة بالجينات المطلوبة الى الخلايا المستهدفة لأجراء التحوير عليها او يكتفي بالخطوة الثالثة اذا كانت العملية تهدف انتاج مادة معينة يمكن انتاجها في E. coli او اي خلية مضيفة اخرى.

5-      الكشف عن الخلايا التي التقطت الجين المطلوب.

الخطوة الأولى : وتتضمن تحضين قطع من DNA ومثلما ذكر أعلاه ان الطرق الانزيمية هي الافضل وتتم بواسطة الانزيمات ومنها :

انزيمات القطع Restriction enzymes :

وهي الاساس في الحصول على قطع DNA المطلوبة وهناك انزيمات اخرى تشارك في عمليات الكلونة في خطوات اخرى ومنها الانزيمات المحررة لكل من DNA و RNA وكذلك الانزيمات اللاحمة.

ولكن في الخطوة الأولى تكون انزيمات القطع هي المهمة وهي من DNAases التي تستطيع تمييز توالي معين من النيوكلوتيدات في أشرطة DNA ثم تفلق الجزيئة في موضع التعرف او موضع مجاور له. وتقسم الانزيمات الى ثلاث أقسام I، II، III، الصنف الأول والثالث لا تستعمل بكثرة في الكلونة الجزيئية ولكن الصنف الثاني هو المستعمل وقد اكتشف عددا كبيرا منها في الاحياء بدائية النواة او عزلت، ويستعمل العديد منها في عملية الهندسة الوراثية.

وتعتمد تسميتها على استعمال الحرف الأول من الجنس للاسم العلمي للكائن مع الحرفين الأولى من اسم النوع، وتستعمل بعدها الارقام اذا كان الكائن ينتج أكثر من انزيم وأغلب الانزيمات في الصنف الثاني تميز توالي مكونا من 4، 5، 6 قواعد والتي تكون متناظرة التوالي Palindromic sequence، لذلك تكون احتمالية وجود مواقع الفلق بنسبة    4ⁿ / 1 و  n تمثل عدد القواعد لذلك فان الانزيمات التي تحتاج الى توالي مكون من 4 قواعد تكون مواقع الفلق لها متكررة كل 256 قاعدة والتي تحتاج الى 6 قواعد تتكرر مواقعها كل 4096 قاعدة، اما التي تحتاج الى 8 قواعد فتتكرر كل 65536 قاعدة، فعندما يراد الحصول على قطع من الجين تستعمل الانزيمات التي تحتاج الى 4 من تواليات القواعد اما اذا كان الجين المطلوب كاملا فتستعمل انزيمات تحتاج توالي من 6 قواعد لتعطي قطع بحجم حوالي 4000 زوج قاعدة اما اذا اريد الحصول على قطعة كبيرة فتستعمل الانزيمات التي تحتاج الى تواليات مكونة من 8 أو أكثر. والانزيمات التي تحتاج الى توالي طويل مثل 10 ، 11، 12، 13، 14، 15 من القواعد تسمى بأنزيمات القطع النادرة وتقوم بقطع قطع كبيرة وتستعمل في كلونة القطع الكبيرة جدا لرسم الخرائط الطبيعية وقد وجد ان بعض الانزيمات المعزولة من أحياء مختلفة تكون متشابهة بالتوالي الذي تتعرف عليه وتقطع في الموقع نفسه وهذه تسمى Isoschizomers كما في SacI و SstI التي تفلق التوالي

' GAG CT *C3'5

'C *TC GAG5'3'3

وعليه فان الانزيمات تختلف بشكل كبير في توالي الموقع التي تتعرف عليها اضافة الى اختلافها في المواقع التي تفلقها، فالبعض تقص الشريطين في الموقع نفسه مؤدية الى انتاج نهايات ملساء للقطع الناتجة (Blunt restriction fragments) ، في حين ان انزيمات اخرى تقطع احد الاشرطة في موقع والشريط الاخر في موقع آخر مؤدية الى انتاج قطع بنهايات لزجة Sticky ends كما موضح في الشكل الآتي (شكل 1)

شكل 30 : مواقع تأثيرات انزيمات القطع على DNA

I-       انتاج نهايات ملساء باستعمال Hpa 1

II-      انتاج نهايات لزجة باستعمال BamH1

وأهم الانزيمات القاطعة المستعملة في الهندسة الوراثية موضحة في الجدول (1)

جدول 4 : اهم الانزيمات القاطعة المستعملة في الهندسة الوراثية

N نيوكلوتيد

Pu قاعدة بيورينية

Py قاعدة بريمدينية

وفي حالة كون الانزيم يؤدي الى انتاج نهايات ملساء فعندما يمكن اضافة قطع صغيرة من النيوكلوتيدات وهي المكيفات Adaptors متكاملة على طرفية قطعة DNA المراد إدخاله وذلك لتسهيل عملية ارتباطه نتيجة لتكامل القطع مع بعضها اعتمادا على ازدواج القواعد والتي يسهل ربطها بإنزيمات اللحم في الخطوة التي تليها. ومن الانزيمات الاخرى المكملة والضرورية موضحة في الجدول (2).

وباختيار الانزيمات الملائمة يمكن تحديد حجم القطع المراد نقلها من جينومات البكتريا او العاثيات. وقد ساعدت خرائط القطع Restriction maps التي وضعت للكشف او تحديد مواقع او اهداف كل انزيم، ومثل هذه الخرائط وضعت لعدد من البلازميدات والعاثيات وكذلك لجينوم E. coli وبعض البكتريا الاخرى.

جدول 2 : الانزيمات المستعملة في الكلونة العامة

وبعد تحضير قطع DNA المطلوبة يتم فصلها باستعمال الهجرة الكهربائية في الهلام Gel electrophoresis وتحويراته مثل Pulse – field gel electrophoresis  او غيرها. ويكون الفصل على أساس الحجم فالقطع الصغيرة تسير أسرع ويؤثر على سرعة الحركة في الهلام الطبيعة الكيماوية للهلام وتركيزه والاتصالات العرضية، فالهلام الحاوي على اتصالات عرضية كثيرة يسمح بفصل قطع صغيرة من DNA، وتصبغ صفائح الهلام بـ Ethidium bromide لتظهر بشكل حزم متفلورة تحت الضوء البنفسجي، او تحدد باستعمال مسابر خاصة، وهذه تسمح بفصل قطع تصل أحجامها الى 100 كيلو قاعدة. ويمكن ان تؤخذ هذه القطع وتضخم بطريقة PCR.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .