لتجهيز الحلم للدراسة المجهرية يمكن اتباع الخطوات الآتية:

1) تنظيف وتوضيح العينات Clearing / Maceration of Specimenss

يتم عادة تحميل الحلم على شرائح زجاجية خاصة بالدراسات المجهرية، هذه العملية تتطلب ان يكون جسم الحلم في الشريحة نظيفة وشفافة خاصة مع الحلم ذو الكيوتكل السميك والغامق وهي مسألة ضرورية لرؤية وفحص التراكيب الدقيقة لجسم الحلم. وعليه فإن توضيح العينة قبل عمل الشريحة مسألة مهمة جدا ويتم هذا باستخدام عدد من المحاليل، من اشهرها محلول لاکتوفينول Lactophenol وهو محلول تنظيف وترويق قوي يتكون من:

50 جزء حامض الخليك Lactic acid

25 جزء بلورات الفينول Phenol Crystal

5 جزء ماء مقطر Distilled Water

كما يمكن استخدام المحلول المائي لحامض الخليك بتركيز 50-95% ايضا في عملية تنظيف وترويق العينات لتجهيزها للدراسة المجهرية.

ان كلا المحلولين يمكن استخدامهما بنجاح لتنظيف وترويق الحلم نباتي التغذية وذلك بوضع عينات الحلم في احد المحلولين لمدة اسبوع على درجة حرارة الغرفة، انواع الحلم الصغيرة الحجم وذات الأجسام الرخوة يمكن تنظيفها بفترة اقل من اسبوع ولتسهيل عملية توضيح عينة الحلم كبير الحجم يمكن عمل ثقب في منطقة الجسم ليتمكن محلول لاکتوفينول من النفاذ بسرعة إلى داخل جسم الحلم، كما يمكن استخدام التسخين لتسريع عملية التنظيف والترويق.

ويفضل نقل عينة الحلم التي تم ثقبها إلى ماء مقطر لتنظيفها من متبقيات محلول الترويق قبل استخدامها في عمل الشريحة المجهرية.

2) عمل الشرائح المؤقتة Temporary Mounts

يمكن عمل شريحة مؤقتة للحلم باستخدام حامض الخليك Lactic acid وذلك بوضع قطرة من حامض الخليك باستخدام قنينة التقطير Droplet bottle الشكل 1) أو باستخدام قضيب زجاجي، توضع القطرة في وسط الشريحة الزجاجية ثم يتم نقل الحلم إلى وسط القطرة بواسطة دبوس أو فرشاة صغيرة بعدها تتم عملية فرد اجزاء الحلم وتوجيه وضعية جسم الحلم بالشكل المناسب للدراسة ويفضل أن توضع عينة الحلم تارة على السطح الظهري واخرى على السطح البطني لكي تسهل عملية دراسة السطح الظهري والبطني وما عليها من صفائح وشعيرات وزوائد. بعد ذلك يتم وضع غطاء الشريحة - ايضا يمكن تحميل الحلم في شريحة مقعرة يتم تغطيتها بغطاء شريحة مربع الشكل.

الشكل (1) قنينة زجاجية تحوي بيئة التحميل فيها قضيب زجاجي يستعمل لوضع

قطرة بيئة التحميل على الشريحة.

3) عمل الشرائح الدائمية Permanent Mounts:

ان عمل الشرائح الدائمية للحلم يتطلب استخدام انواع معينة من بيئات التحميل للحفاظ على عينة الحلم سليمة لأطول فترة ممكنة، ان من اهم البيئات المستخدمة في هذا المجال ما يأتي:

أ-) بيئة هوير s media'Hoyer:

وهي من اشهر البيئات التي استخدمت في عمل الشرائح الدائمية، يتم تحضير هذه البيئة من خلط المكونات وبالنسب الآتية:

25 ملم ماء مقطر Distilled Water

15 غم صمغ عربي Gum Arabic

100 غم کلورال هايدريت Chloral Hydrate

10 مل کليسيرين Glycerine

ويقتضي استخدام الصمغ العربي بشكل بلورات وليس بشكل مسحوق وان تتم عملية الخلط عند درجة حرارة الغرفة، والمحلول الناتج يتم ترشيحه باستخدام عدة طبقات من قماش الململ أو الصوف الزجاجي.

أن أهم ما يميز هذه البيئة هو انها تعمل على زيادة وضوح عينة الحلم، خاصة الحلم النباتي قليل التصلب، فضلا عن خواصها البصرية. وهي سهلة الاستخدام.

يراعى عند تحميل العينة على بيئة هوير ما يلي:-

• إذا كان قد تم استخدام حامض الخليك في تنظيف العينة وترويقها، فإنه لابد من غسل عينة الحلم بالماء المقطر قبل تحميلها في بيئة هوير لإزالة متبقيات حامض الخليك والانسجة المتحللة وذلك لمنع تحلل وتكسر النموذج سريعا.

• ان بيئة هوير هي مادة سامة جدا وينبغي التعامل بحذر شديد ويفضل غسل اليدين بشكل جيد بعد الاستعمال.

• عند تحميل ذكور الحلم العنكبوتي من عائلة Tetranychidae ينبغي تحميلها بشكل جانبي لكي تظهر ألة السفاد بشكل واضح لأهميته في عملية التمييز بين الأنواع.

ب) بيئة اللاكتوفينول Lactophenol Media

استخدمت هذه البيئة ايضا من قبل بعض علماء الأكاروسات كبديل لبيئة هوير ومن اهم بيئات اللاكتوفينول بيئة s P. V. C' Heinzeوالتي يتم تحضيرها من مزج المكونات بالنسب الأتية:-

10 غم بولي فينايل الكحول Polyvinyl Alcohol

60 - 40 مل ماء مقطر Distilled Water

35 مل حامض الخليك (85-92%)Lactic acid

10 مل کلیسرول Glycerol

100 غم کلورال هايدريت Chloral Hydrate

بعد تحضير البيئة يفضل وضعها في زجاجة غامقة.

ت-) بيئة الراتنج Resin - Based Media:-

من هذه البيئات بيئة كندا بلسم Canada Balsam وكذلك الEuparal. هذه البيئات يمكن استخدامها لعمل شرائح دائميه، الا ان هناك بعض المحددات لاستخدامها في مجال الأكاروسات منها ضعف خواصها البصرية وصعوبة وضوح العينة وتجفيفها، الا أن الباحث Saito وأخرون (1993) يعتقدون أن استخدام الكندا بلسم كان جيدا مع الحلم العنكبوتي وانواع اخرى من الحلم.

بعد اختيار بيئة التحميل المناسبة يتم عمل الشريحة الدائمية وفق الخطوات الآتية:-

1-) يتم وضع قطرة من محلول هوير أو أي بيئة تحميل في وسط الشريحة الزجاجية.

2-) ضع نموذج الحلم في وسط قطرة محلول هوير ثم يتم فرد اجزاء الحلم باستعمال النيدل.

3-) قبل وضع غطاء الشريحة، يتم تجفيف الشريحة إلى أن تستقر بيئة التحميل ويلتصق الحلم على الشريحة بشكل جيد ويتم التجفيف داخل فرن أو على صفيحة حارة عند درجة حرارة 40م لأكثر من ثلاث ساعات.

4-) ضع قطرة اخرى من بيئة هوير ثم ضع غطاء الشريحة فوق حافة قطرة بيئة التحميل ثم يوضع غطاء الشريحة على كامل القطرة بهدوء لمنع تكون فقاعات هوائية.

يفضل عند الانتهاء من عمل الشريحة أن يتم تأشير موقع الحلم في الشريحة وذلك بعمل دائرة حول الحلم بواسطة قلم ماجك. كما يفضل تسخين الشريحة على درجة 60م إلى أن تتوضح العينة ثم يتم كتابة المعلومات الخاصة بالشريحة من حيث تاريخ الجمع، موقع الجمع، العائل النباتي وغيرها من المعلومات.

5-) ضرورة عمل حلقة حول غطاء الشريحة من مادة Glyptal وهي صبغة مانعة

للماء باستخدام فرشاة رقم (1) بعد وضع الشريحة على لوح دوار. (الشكل 2).

الشكل (2) لوح لعمل حلقة على غطاء الشريحة باستخدام فرشاة ومادة ال Glyptal.