عزل وتشخيص البروتينات الفايروسية

يتم عزل البروتينات الفايروسية بفك ارتباط الكابسيد البروتيني عن الحامض النووي من دون إتلاف لذلك البروتين وذلك لدراسة تركيبه الأولي ومعرفة تعاقب أحماضه الامينية، وتستعمل عادة الطرق الخمسة التالية لفصل البروتين الفايروسي وهي:

1. طريقة الملح الساخن

هي ذات الطريقة المستعملة مع الحامض النووي.

[طريقة الملح الساخن لعزل وتشخيص الأحماض النووية الفايروسية

استعملت طريقة الملح الساخن Hot Salt method لأول مرة لفصل الحامض النووي لفايروس موزانيك التبغ (TMV) من قبل Knight سنة 1975 وهي طريقة شديدة لا تتحملها معظم الفايروسات باستثناء الثابتة منها لأنها تنفذ تحت درجة حرارية عالية تصل إلى 100م حيث يغلى المحلول الفايروسي مع محلول كلوريد الصوديوم تركيز 0,3 مولر لمدة دقيقة ثم يبرد فورا تبريدا شديدا ويفصل عن البروتين الفايروسي بالانتباذ على قوة 10000 g الذي يترسب تاركا الحامض النووي في الرائق الذي تتم ديلزته Dialysis لإزالة ايونات الصوديوم والكلوريد، يمكن استعمال الايثانول المبرد 67% لترسيب الحامض النووي ثم تعاد إذابته بالماء، إن هذه الطريقة تضمن الحصول على حوالي 80% من الحامض النووي الفايروسي].

2. طريقة الفينول

هي ذات الطريقة المستعملة مع الحامض النووي، حيث ينفصل البروتين ذائبا في الفينول تاركا الحامض النووي في الطبقة المائية ثم تضاف إلى الطبقة الفينولية بعدئذ 5-10 حجوم من الميثانول وزوج من البلورات الصغيرة لخلات الصوديوم فيترسب البروتين نقيا بواسطة الانتباذ ويغسل بالإيثر ويجفف هوائيا.

3. طريقة القلوي الخفيف

استعملت طريقة القلوي الخفيف Mild alkal method لعزل بروتين فايروس موزائيك التبغ (TMV) بتعريض المحلول الفايروسي النقي إلى محلول قلوي خفيف حيث يستعمل عادة هيدروكسيد أو بورات أو كاربونات الصوديوم أو أمين الإيثانول

Ethanolamine عند أس هيدروجيني بقيمة 10 فيتحرر البروتين ويفصل بالانتباذ.

4. طريقة حامض الخليك الثلجي البارد

تستعمل طريقة حامض الخليك الثلجي الباردCold glacial acetic acid method بديلا عن الطريقة السابقة بسبب حساسية بعض الفايروسات للقلويات لذا تستبدل بحامض الخليك الثلجي تركيز 67% والذي يمزج بمقدار حجمين لكل حجم من المحلول الفايروسي النقي في حمام ثلجي مع الرج لمدة ساعة فينفصل البروتين عن الحامض النووي ويفصل بترسيبه بالانتباذ.

5. طريقة مساحيق التنظيف

هي ذات الطريقة المستعملة مع الحامض النووي، ولكن سلبيتها أنه عند استعمالها لعزل البروتينات الفايروسية فأن حوالي 15% من كمية البروتين ترتبط مع مادة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) كما أن هذا المركب يدنتر البروتين أي يحطم التركيب الثاني والثالثي للبروتين وهذا يعني تحطيم الأواصر الايونية وفقدان البروتين لتركيبه الالتفافي مما يؤدي إلى تغيير شحنته وبالتالي خصائصه الكيموفيزيائية.

6. تحليل الأحماض الامينية الفايروسية

بعد عزل البروتين بإحدى الطرق الخمسة المذكورة أعلاه يتم تحليل الأحماض الامينية لمعرفة تعاقبها في سلسلة الببتيد المكونة لذلك البروتين حيث يمثل ذلك التعاقب صفة خاصة لكل نوع فايروسي، أي أن تعاقب الأحماض الأمينية في بروتين كابسيد فايروس معين لا يتماثل مع فايروس من نوع آخر لذلك فان هذه هي إحدى الصفات التشخيصية المعتمدة الأن للفايروسات، ويتم التحليل بتفكيك الأحماض الامينية المكونة للتركيب الأولي للبروتين بواسطة التحليل المائي للبروتين بتسخينه تحت الضغط مع كمية قليلة من حامض الهيدروكلوريك تركيز 6 مولر في أنبوبة زجاجية سميكة الجدار ومحكمة القفل وعند حرارة 110م لمدة 22 – 72 ساعة ثم تحدد أنواع وكميات الأحماض الامينية المكونة للبروتين باستعمال جهاز "محلل الاحماض الامينية Amino acid analyzer المتكون من عمود فصل باستعمال هلام التبادل الأيوني lon exchange resin وقارئ المخططات البياني Charter recorder ويعمل الجهاز بإضافة محلول الأحماض الامينية إلى عمود الفصل وعند مرورها فيه تتكرر حالات ادمصاصها وازاحتها بسرع تعتمد علي الاختلافات في تركيبها الكيماوي ثم يتم تفاعل الراشح مع محلول "النهايدرن" Ninhydrin ويقاس اللون الناتج بواسطة قارئ لوني Colorimeter تسجل قراءته على مخطط ورقي، ويتم تعريف الأحماض الامينية حسب ترتيب ظهور محاليلها من العمود وتسجيل ذروات المنحنيات التي يعطيها كل حامض أميني ومقارنتها بالمحاليل القياسية حيث تقدر كمية كل حامض أميني بمقارنة المساحة التي يحصرها منحنى الحامض مع مساحة منحنى الحامض الاميني القياسي المعروف الحجم والكمية، وبسبب تلف الحامضين الامينيين "السستين" و "التربتوفان" نتيجة عدم ثباتيتهما عند هذه الظروف القاسية الاختبارية وخاصة درجات الحرارة العالية لذلك يتم الكشف عنهما بالطرق اللونية Colorimetric methods، يستعمل أيضا جهاز الكروماتوغرافيا السائل عالي الاداء High Performance Liquid Chromatography, HPLC للغرض ذاته.

7. تحديد المجاميع الطرفية للبروتين الفايروسي

تعد عملية تحديد المجاميع الطرفية للبروتين Protien end group إحدى الاختبارات المهمة لتعريف البروتينات الفايروسية إذ يتكون البروتين من تعاقب خطي غير متفرع لأحماض امينية متتالية ويطلق على الجزء الأيسر من الشريط الببتيدي الطرف الأميني" Amino terminal، أو N-terminal أما الجزء الأيمن من الشريط فيسمى الطرف الكاربوكسيلي terminal Carboxyl أو C-terminal ويتم التعرف على هذين الطرفين بشطرهما أنزيميا حيث يستعمل إنزيم الكاربوكسييبتيديز Carboxypeptidase المعزول من البنكرياس أو إنزيم الكاربوكسيبيبتيديز المعزول من أشجار الحمضيات أو نباتات أخرى، وتعمل هذه الإنزيمات على الطرف الكاربوكسيلي فتكسر الأصرة الببتيدية وينفصل حامض أميني ثم الذي يليه ويطلق على عملية تحرير الأحماض الامينية بهذه الطريقة بتفاعل Hydrazinolysis، أما تحريرها من الطرف الاميني فتتم باستعمال مركب الفلوروداينايتروبنزين fluorodinitrobenzene والتي تعرف اختصارا FDNB حيث تتفاعل مجموعة الأمين الطرفية مع هذا المركب، ويمكن استعمال طريقة "تحلل أيدمان" Edman degradation والذي يسمى أيضا "تفاعل الفينيل - أيزوثايوسيانيت" (PTC) Phenyl-isothiocyanate reaction بديلا لمركب FDNB ثم تتم قراءة الطيف الامتصاصي للأحماض الامينية المتحررة عند الطول الموجي 260- 275 نانومتر وتقارن بمحلول قياسي لكل حامض أميني معروف وبذلك يتم التعرف على أنواع وتعاقب الأحماض الامينية للكابسيد الفايروسي.

8. التحسس الضوئي للبروتين الفايروسي

من الصفات الطبيعية للبروتين التركيبي الفايروسي تحسسه للضوء العادي، وتعرف هذه الظاهرة بمصطلح "التحسس الضوئي" Photosensitization أو "الديناميكا الضوئية" Photodynamics وتحدث عند ربط صبغات متفلورة ومنها صبغة الاكريفلافين Acriflavin مع الفايروس حيث ترتبط مع الكابسيد ويحصل تغيير في الأحماض الأمينية وخاصة التربتوفان والتايروسين والميثيونين والهستدين فتصبح حساسة للضوء العادي، كما تحصل هذه الظاهرة أيضا عند مزج الفايروس مع صبغة ازرق المثيلين وتعريضه للضوء.