التحليل الشامل لفعاليات البروتينات باستخدام رقائق البروتيوميات

‏لتسييل دراسة بروتينات الخمائر ، تم استبسال اكثر من 2800 ‏نسق قراءة مفتوحة (جين) وبعدها تم التعبير عن تلك الجينات بصورة مفرطة ومن ثم تم تنقية البروتينات الناتجة عن ترجمتها .

‏بعد ذلك تم تثبيت او طبع تلك البروتينات على شرائح بكثافة فراغية لتكوين مصفوفات مجهرية من بروتينات الخميرة ومن ثم دراسة قدرتها على التداخل مع البروتينات الاخرى ومع الدهون المفسفرة ، كما تم تشخيص العديد من البروتينات المتداخلة مع الـ calmodulin والدهون المفسفرة ، لذلك يمكن تحضير مصفوفات مجهرية لكامل البروتيوم في حقيقية النواة ، كما يمكن دراسة وملاحظة الفعاليات الكيموحيوية المتباينة . هذه المصفوفات المجهرية يمكن استخدامها لدراسة التداخل بين البروتينات والعقاقير ، وكذلك لتحديد التحويرات فيما بعد الترجمة .

‏- الخطوة المهمة بعد تحديد تسلسل كل بروتيوم هي فهم الوظائف والتحويرات والتنظيمات لكل بروتين مشفر . حيث ان الكثير من الجهود كرست باتجاه دراسة الجينات والبروتينات والوظائف والتنظيمات بواسطة تحليل انماط تعبير الرنا الرسول (mRNA) والطراز المظهري للتعطيل الجيني ، وتداخل الهجائن الثنائية وتحديد البروتينات تحت الخلوية ، عنى الرغم من كون هذه الدراسات مفيدة الا ان الكثير من المعلومات عن وظائف البروتينات ممكن اشتقاقها من تحليل الفعاليات الكيموحيوية .

‏اساس الفعاليات الكيموحيوية للبروتين ممكن تعليمها جهازيا بإنتاج بروتينات ذات طراز عالي التمييز ، وتحليل وظائف المئات او الاف من عينات البروتينات في نفس الوقت او بصورة متوازية باستخدام المصفوفات المجهرية .

ان العائق الرئيسي في دراسة كامل مصفوفات البروتيوم هو الامكانية على توليد نسائل ضرورية التعبير ، وكذلك تعبير وتنقية البروتينات في الطراز عالي التمييز .

هذا وتتوفر مصفوفات بروتيوم الخميرة المكونة لما يقارب 80 % من بروتينات الخميرة ، والتي تمت دراستها وتوضيح العديد من فعالياتها الكيموحيوية .

تضمنت الخطوة الاولى بناء أدلة عالية النوعية لـ 5800 نمط قراءة مفتوح للخميرة (ORFs) (93.5 % من المجموع الكلي) تكلون او تستنسل في نواقل عالية التعبير باستخدام كلونة او الاستنسال بالتأشيب .

بروتين الخميرة ينتشر الى الكلوكائيون اس – ترانسفيريز متعدد الهستدين عند طرفها الاميني (NH₂) ويحصل لها تعبير في الخميرة باستخدام بروموتر الكلاكتوز المحفز . ان سلالات الخمائر المستخدمة في التعبير تحتوي على بلازميد مفرد والذي يبدو انه فيه الـ ORFs الصحيح يكون مرتبط في نفس النسق بالـ GST بواسطة تسلسلات الدنا .

وهذه البروتينات يحدث لها تعبير في الخميرة  ليساعد في التأكد من البروتينات المحورة وخواص الطيات . باستخدام 96  ‏تركيبة جيدة ، 1125 عينة تم تنقيتها في مرة واحدة من مستخلص الخميرة باستخدام كريات او خرزات اكاروز – كلوتائيون . ويضاف اليها 0.1 % ترايتون في المحلول المنظم الحال وتغسل للتأكد من ان البروتين المنقى خالي من الدهون . نوعية وكمية البروتين المنقى يتم الكشف عنها باستخدام تحليل الوصمات المناعية لـ (20 ‏) عينة عشوائية . اكثر من 80 % ‏من السلالات المنتجة لكميات واضحة يمكن التحري عنها من خلال الوزن الجزيئي للبروتينات المنشرة .

‏لتحضير رقائق بروتيوم ، نطبع 6566 من البروتينات المحضرة تمثل 5800 ‏بروتين خميري مختلف بشكل مكررات او اوزواج على شريحة زجاجية باستخدام المرصاف المجهري المتوفر تجاريا . في تجاربنا البدائية استخدمنا شرائح مجهرية معاملة بالالديهايد تلتصق فيها البروتينات المنتشرة على السطح من خلال الامينات الاولية عند النهاية NH₂- او الثمالات الاخرى من البروتين . وفي تجارب لاحقة تم وصم البروتينات على شرائح مغطاة بالنيكل وتلتصق فيها البروتينات المنتشرة خلال اربطتها Hisx6 وباتجاه واحد بعيد عن السطح . وكلا الشريحتين السابقتين ناجحة ، الشريحة المغطاة بالنيكل تعطي اشارات ممتازة للبروتينات التي تم تحضيرها .

‏لتحديد كمية البروتينات المنتشرة والمرتبطة تساهميا الى سطوح الشرائح المختلفة وتوضيح ارتباط البروتينات تعلم او توّسم الرقائق بالأجسام المضادة للـ (Anti GST) GST . اكثر من 93.5 % من عينات البروتينات اعطت اشارات معنوية على المادة الاساس (مثال : اكثر من 10 ‏فمتوغرام من البروتين) و 90% من الوصمات احتوت 10-950  ‏فمتوغرام من البروتينات . أظهرت النتائج كذلك البروتينات على شكل بقع بقوة تمييز ممتازة 13,000 ‏عينة في نصف مساحة الشريحة المجهرية القياسية . ولاختبار شكل بقع البروتينات تقارن الاشارات الظاهرة بين كل زوج من المكررات مع الاخر . 95% ‏من الاشارات كانت ضمن 5% من المعدل . الرقائق البروتيومية فحصت بتعليم او توسيم العديد من حالات التداخل بين بروتين واخر وبين البروتينات والدهون . ولاختبار التداخل بين البروتينات يوسم بروتيوم الخميرة بالبايوتينيليد كالموديوليسن بوجود الكالسيوم الكموديولين شديد الالفة للارتباط مع البروتينات المرتبطة بالكلسيوم باشتراك العديد من العمليات الخلوية المنظمة للكالسيوم . والاصرة بين البيوكانيليد والبروتين يتم التحري عنها باستخدام الستربتافيدين الموسم CY3 . كذلك يتم التوسيم بالستربتافيدين الموسم CY3 لوحده فقط كسيطرة .

‏هذه الدراسات شخصت ستة اهداف معروفة للكالموديولين Dst 1p تلعب دور في اطالة الاستنساخ Myo 4p هي الصنف 7 ‏ للسلسلة الثقيلة للمايوسين ، ‏ Arc35p هي مكونات المعقد الخيطي المنتظم للـ Arc35p , Arp2/3 ‏كانت في الفترة الاخيرة توضح التداخل مع الكالموديولين في دراسة الهجائن الثنائية . وهكذا اكدت النتائج ان الـ Arc35p والكالموديولين تتداخل مختبريا . اهداف الكالموديولين المعروفة التي لم يتمكن من الكشف عنها اثنين لم تكن ضمن البيانات التي جمعت والبقية لم نتمكن من الكشف عنها في تجارب التوسيم بالـ Gst . اضافة الى ذلك التوسيم بالكالموديولين شخصت 33 ‏ مترافقة اضافية محتملة هذه تضم انواع مختلفة عديدة من البروتينات متطابقة مع دور الكالموديولين في العديد من السيرورات الخلوية المختلفة . البحوث المتعاقبة كشفت ان 14 من 93 من البروتينات المرتبطة بالكالموديولين  تحتوي صيغة ثابتة هي (IIL)QXXR(KIX)GB حيث x تمثل اي ثمالة و B تمثل الثمالة الاساسية .

‏ان التسلسل المرتبط في المايوسين IQXXXXKXXXR المبنية سابقا مرتبطة مع الكالموديولين وهكذا اوضحنا القبة الموجودة في العديد من البروتينات المرتبطة بكالموديولين . وعلى افتراض ان الاهداف الاخرى فاقدة للصيغة الموضحة فإن لها تسلسلات اخرى ترتبط بالكالموديويلن .

‏اضافة الى الاهداف المرتبطة بالكالموديولين تم تشخيص بروتين pyClp الذي يرتبط بالستربتافيدين الموسم -  PYCIP.CY3 ‏يشفر للبايروفيت كاربوكسيليز 1 المماثل الذي يحتوي على منطقة عالية الثباتية للارتباط بالبايوتين ، وذلك للتنبؤ بتسلسلاتها ، PYCIP مرتبطة مع البايوتين داخل الحي . وبالتحليلات الملائمة للتحري نحن نتوقع امكانية استخدام الرقائق البروتيومية في تشخيص انواع عديدة من التحويرات ما بعد الترجمة في البروتينات .

‏لاختبار امكانية استخدام الرقائق البروتيومية لتشخيص الفعاليات التي قد لا تكون ممكنة بالطرق الاخرى مثل التداخل بين البروتين والعقاقير ، والتداخل بين البروتينات والدهون التي تم تطبيقها على البروتينات المرتبطة بالفوسفو اينوسيتيد (PI) ، ان الـ PIs  ‏هي احد المكونات المهمة للغشاء الخلوي ، وكذلك تعمل كمرسال ثاني ينظم السيرورات الخلوية المختلفة والتي تنظم النمو والتمايز واعادة ترتيب الخلايا الهيكلية ، ونفاذية الاغشية . ولأنها غالبا توجد فقط وقليلة الوفرة في الخلية ، PIs تملك صفات واسعة ، والمعرفة قليلة حول ارتباطها بالبروتين ومختلف الدهون المفسفرة خمسة انواع من الـ PIs  ‏في الليبوسومات ، ولايبوسوم واحد فاقد الـ PI يستخدم في توسيم الرقائق البروتيومية ، وجميعها تحتوي على الفوسفوتيدايل كولين (PC) بـ 1 % من N-(biotinyl)- 1,2dinexade-canoyl-sn-glycerol (w/w) وملح (biotinDHPE) الدهون الحاوية على بروتين تعمل كمادة واسمة والتي يمكن التحري عنها بواسطة الستربتافيدين CY3 . اضافة الى الـ (PC) واللايبوسومات الخمسة الاخرى تحتوي اما5% PI(3,4)P2,PI(3,4)P2,PI(4)P  أو PI(3,4)P3 . كل هذه الدهون المفسفرة توجد في الخميرة عدا PI(3,4)P3 . اللايبوسومات الستة المشخصة هي مجموع 150 هدف بروتيني مختلف والتي تعطي اشارات عالية النوعية اكثر من المادة الاساس . ان الكورنم كلن الموسيلة التي تساعد في تشخيص الاشارات الموجبة . اثنان وخمسون (35%) من البروتينات المرتبطة بالدهون مطابقة لبروتينات غير موصفة ، من الـ 98 ‏ بروتين المعروفة ثمة 45  ‏بروتين مرتبط بالأغشية فهي تمتلك او يعتقد انها تمتنك مناطق محددة في الاغشية وهذه تتضمن بروتينات متداخلة مع الاغشية ، مع بعض التحويرات في الدهون مثلGPI  وهذه ترتبط محيطيا مع الاغشية . الانواع الثمانية الاخرى تشترك في ايض الدهون مثل BpIIp او فسفرة حلقة الانيوسيتول مثل kcsIp او يعتقد انها تشارك في وظيفة الاغشية او الدهون مثل Yir020cp له تماثل مع الانزيم المحلل للكليسيريدات الثلاثية .

‏من الاثنين وخمسين بروتين الغير موصوفة ، (25%) 13 يعتقد انها مرتبطة مع الاغشية ، والبعض الاخر تحتوي امتدادات قاعدية يتوقع انها تعمل على التداخل الالكتروستاتيكي مع الدهون ذات الشحنة السالبة : (19) من البروتينات المرتبطة بالدهون تمتلك فعالية الكاينيز و 17 من هذه لها فعالية البروتين كاينيز . البروتينات المرتبطة بالدهون المفسفرة صنفت الى مرتبطة بقوة او مرتبطة بصورة ضعيفة على اساس اشارة الارتباط بالدهون المفسفرة التي تتناسب مع كمية  الـ GsT .

‏حيث وجدنا اكثر من 72 % منها ترتبط بالدهون بصورة قوية و54% ‏ترتبط بصورة ضعيفة والبروتينات الاكثر ارتباطا بالدهون معروفة او يتوقع انها مرتبطة مع الاغشية ، وتتعلق بالبروتينات الاقل ارتباطا .  13من 17 انزيم كاينيز البروتين ترتبط بصورة قوية مع الـ PI ‏ . تم تقسيم البروتينات بحسب ميلها للارتباط مع واحد او اكثر . الـ PIs  ‏فوق 101 . PI . بروتين ترتبط مع الـ PC احسن من ارتباطها مع الـ  49.PI بروتين ترتبط مع واحد او اكثر من الـ PIs ‏بصورة ممتازة . تحليل البروتينات المرتبطة مع الـ PI ‏بقوة كشفت ان العديد منها يرتبط بصورة خاصة مع الـ PI المعينة ، مثل ذلك الـ Step22p المستخدمة في استهدافا البروتينات الفجوية في الغشاء البلازمي مثل step2p و can1p ترتبط بصورة جيدة مع الـ PI(3)P . انزيمات الكاينيز التسعة ترتبط بصورة خاصة مع PI(4)P و  PI(3,4)P₂‏وبصورة قوية ، وواحد فقط من انزيمات الكاينيز يرتبط مع الدهون بصورة ضعيفة . Atp1p  ‏الوحدة الثانوية للـ F1-ATP  ‏سنثيتيز العائد للغشاء الداخلي للمايتوكوندريا ايضا ترتبط مع الـ PI(4,5)P₂ بصورة قوية . الارتباط الممتاز للـ MY04P قد يكون ههم لتداخلها عند قشرة الخلية و / او تنظيمها . لا توجد اهداف للارتباط مع الدهن ، والتي ترتبط بصورة نوعية بالـ PI(3,4,5)P₃ ، معظم البروتينات ترتبط مع هذه الدهون والدهون الاخرى .

‏هذه النتائج اظهرت العديد من البروتينات المتحدة مع الاغشية ومن ضمنها البروتينات المتداخلة في الاغشية والبروتينات المحيطة للأغشية ترتبط مع الدهون المفسفرة النوعية داخل الحي .

البروتينات العديدة المشتركة في ايض الكلوكوز شخصت كبروتينات مرتبطة بالدهون المفسفرة . وهذه يضم (1) ثلاثة انزيمات تشترك في خطوات تحليل السكر المتتابعة (فوسفو كليسرين ميوتيز GPM3P , و الانيوليز (En02p) ، والبايرفيت كاينيز (ii) (PYK1Cdc 1,P) هيكسوكاينيز (HxKIP) و (iii) اثنين من البروتين كاينيز Rimp15p و snfIP ومن المفاجئ ، ان الدراسات السابقة اشارت الى ان بعض هذه البروتين كاينيز Rimp15p و snfIP ومن المفاجئ ، ان الدراسات السابقة اشارت الى ان بعض هذه البروتينات قد تتداخل مع الدهون . HxKIP ترتبط مع الايونات الهجينة التي تحفز فعاليتها ، En02p فدوره مجهول ، ولكن يعتقد انه يتداخل مع الاغشية . هذا و يأمل او يعتقد ان الخطوات المنظمة للدهون المفسفرة المشتركة في ايض الكلوكوز او العديد من الخطوات المهمة في ايض الكلوكوز تحدث على سطح الاغشية . وفي الحالة الاخيرة فالدهون المفسفرة ستعمل كسقالة او سطح ساند لحدوث خطوات التحلل السكري بكفاءة . ستة بروتينات غير متوقع اشتراكها في وظيفة الغشاء او تأشير الدهون . وان    كل من الـ Rimp15p En02P , Hx19P, SpsiP  و Yg1059wp فحصت بكثرة للاختبار   قابليتها على الارتباط مع الـ PI باستخدام نوعين من التحليلات القياسية . لثلاثة بروتينات Hx 19P ,Rim15p ,En02P , اللايبوسومات الحاوية على الـ PI(4,5)P₂ كانت ترتبط اولاً بغشاء النايترو سليلوز بكميات مختلفة من البروتينات المخلوطة مع الـ GsT و GsT المستخدمة كسيطرة كانت مستخدمة لتوسيم الاغشية . كل البروتينات المندمجة مع الـ GsT كانت ترتبط بشدة مع الـ PI(4,5)P₂ بينما الـ  GsT لوحده لا يربط بها .

كذلك تم اجراء تحليل عكسي للبروتينات المندمجة بالـ GsT مع كل من , SpsiP ,Rim15p, Yg1059wp و GenIP . كميات متباينة من تلك البروتينات المنقاة تم وصمها على النيتروسليلوز ووسمت ستة لايبوسومات مختلفة . اللايبوسومات المرتبطة معها كانت تحدد باستخدام انزيم بريوكسديز فجل الحصان ( HRP) مقترنا مع الستربتافيدين . كذلك مع الرقائق المجهرية ، الليبوسومات ترتبط مع كل بروتين ، لكن ليس مع البومين مصل البقرة المستخدمة كسيطرة . SpsiP ترتبط اللايبوسومات الحاوية على PI  ‏بصورة متساوية تقريبا . Yg1059wp و Rim15p ‏و Gen2P و~ تعرض او توضح (تعطى) الفة مختلفة مع الليبوسومات المختلفة PI(3)p, Rim15p  ‏و PI(4)P, PI(3)P ‏و PI(3,4)P₂ ترتبط بقوة ، في كل حالة ، الانحدار الخطي بين اشارات الارتباط ومستوى البروتين قد اوضحت وبصورة ملخصة ، هذه النتائج تبين ان البروتينات المرتبطة بالـ PI شخصت في المصفوفات البروتيومية ، كذلك ارتباط الدهون بتحليلات التقليدية ، علاقة واحدة والتي كانت سبب ان البروتينات كانت منقاة من الخمائر ، وقد تم تحيد تداخل غير مباشر من خلال البروتينات المرتبطة معظم التداخلات التي تم تحديدها كان من المتوقع كونها بصورة غير مباشرة او على الاقل ترتبط بصورة قوية مع البروتينات المهمة ، لان البروتينات كانت منحصرة باستخدام ظروف صارمة (قاسية) ، وفي سبعة عينات فحصت كانت حزم التلوث غير محددة باستخدام تصبيغ كوماسي . المحددات الاخرى كانت الطيات خارج الخلوية للقمم بصورة مناسبة واسرار البروتينات والتشابه لتكون تحت التمثيل في نتائجنا ، لان الـ GsT واربطة HisX6 التي كانت مندمجة عند الطرف الأميني , -NH₂ لذلك البروتينات التي لها اشارة دهنية قد لا تكون مخلقة للمسلك الافرازي وكذلك قد لا تكون مطوية او محورة بصورة مناسبة رغم ذلك فقد تم الكشف ثلاثة بروتينات الحاوية على الاشارات الدهنية ، ويقترح انها على الاقل بعض منها ينتج ويحتوي قمم (دينات) وظيفية . المحددات الاخرى هي ان ليس كل التداخلات كانت محددة وذلك لأنه ليس كل البروتينات تندمج بشكل مفرط في الحقيقة ، وتنقى في هذه ‏الطريقة المتطورة . ومن المتوقع أن 80 % من بروتينات الخمائر المعمولة بشكل مصفوفات كانت بطولها الكامل ولمستويات معقولة لغربلتها .

‏وبغض النظر عن استخدام الرقائق البروتيومية لما لهذه الطريقة من فوائد مهمة كميات التعبير العشوائي غير تامة ، الكلزنات غالبا ليست في كامل طولها والمكتسبات كانت عمليات متعبة لغرض التوضيح الطريقة المتكررة الاستخدام مؤخراً كانت لتوليد حزم معروفة وفحصها باستخدام ستراتيجية الاستقطاب التي تتطلب خطوتين ،  العدد النهائي للبروتينات المفحوصة او المغربلة غير معروف والطريقة لا تعمل بشكل جيد عندما يوجد اعداد كبيرة من البروتينات المتفاعلة ، لان كل حوض سيفحص ايجابيا . الطريقة الاخرى لتحديد التداخل هي طريقة الهجائن الثنائية . والتي فيها التداخل يحدد بصورة نموذجية في النواة ، لذلك تحديد الانواع من التداخلات والممكنة ان تكون محددة .

‏الفائدة من طريقة الرقائق البروتيومية هي ان مواقع شاملة للبروتينات المفردة ممكن ان تفحص مباشرة في المختبر لمدى واسع من الفعاليات المختلفة . من ضمنها تداخل البروتين مع العقاقير وتداخل البروتين مع الدهون ، والتحليلات الانزيمية باستخدام مدى واسع من الظروف المختبرية .

‏اضافة الى ذلك ، البروتينات تحضر لمرة واحدة ، لذلك فحص البروتيوميات يكون اسرع وارخص بصورة كبيرة .

‏باستخدام طرق متشابهة والتي ممكنة لتحضير المصفوفات البروتينية لعشرة الى مئة الف بروتين للتحليل البروتيومي الشامل في الانسان والكائنات حقيقة النواة الاخرى .

تعد شركة سفيرجين " Ciphergen " الامريكية من الشركات الرائدة في تصنيع الرقاقات البروتينية بتقنيات جديدة والتي تستند الى استحثاث السطوح باستخدام الليزر وتسمى التقنية Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation (SELDI) وتنتج شركة - microtechnology center Hut,biomedicum , Helsinki DDTC- viikki الفنلندية مصفوفة رقاقة البروتين باستخدام اجهزة بالغة الدقة وتستخدم لأعراض التشخيص (الشكل 1) .

الشكل (6-9) : يوضح مصفوفة رقاقة البروتين من ناحية التركيب (E) (d) (C) structure في حين يوضح الشكل (A) مخطط الآلة المصنعة للمصفوفة و (B) آلة التصنيع