على الرغم من حساسية تقنية الـ PCR التقليدية في الكشف عن التسلسل الهدف الا ان ليس لها القدرة على اعطاء نتائج "كمية" أو حقيقية عن وفرة التسلسل الهدف، فعلى سبيل المثال، عندما يقوم الباحث باستخدام هذه التقنية التقليدية لغرض الكشف عن جين ما، ويستخدم في ذلك تفاعلات تضخيمية في أنابيب PCR مختلفة، فانه ليس من الضرورة أن تكون كثافة حزمة الـ PCR الناتجة  هي دلالة على  وفرة نسخ ذلك الجين لأننا ليست لدينا الوسيلة الملائمة لاجبار البوادئ على تضاعف الجين الهدف من أول دورة (شكل 1). وعندما يكون المراد هو المعرفة الكمية لعدد نسخ التسلسلات الهدف يصار الى تقنية تدعى بالـ PCR الواقعي الكمي.

الشكل (1) عدم مقدرة تقنية الـ PCR التقليدية في إعطاء توصيف كمي حقيقي عن عدد نسخ التسلسل الهدف. على الرغم من وجود التسلسل الهدف في حسب الحزم المبينة في المسارات من 3 الى 7 ، الا انها وجدت بكثافات مختلفة ، لا تعكس تلك الاختلافات في الكثافة بالضرورة اختلافات في عدد نسخ التسلسل الهدف ( Al-Shuhaib et al., 2011)

ان هنالك العديد من تطبيقات الـ PCR والتي تكون ذات أهمية في المعرفة الكمية للمادة البادئة. نظرياً ، هنالك علاقة كمية بين مقدار المادة البادئة (التسلسل الهدف) ومقدار ناتج الـ PCR في أي دورة من دورات الـ .PCR ولكن عملياً، تعطي تفاعلات الـ PCR كميات مختلفة من الناتج ، وهذا يجعل المعرفة الكمية متعذرة. ان أول تجربة مهدت الطريق في استخدام التحليل الكمي في الـ PCR نشرت عام 1993، حيث استخدم فيها صبغة بروميد الاثيديوم (ethidium bromide) للمعرفة الكمية بنواتج الـ PCR اثناء تراكمها. يقوم التضخيم بانتاج كميات متزايدة من الـ DNA ثنائي الشريط، والذي يرتبط بصبغة بروميد الاثيديوم، وهذا ينتج في زيادة في التفلور. واذا ماوضع مخطط يوضح الزيادة في التفلور مقابيل رقم الدورة يكون من المعقول تحليل تفاعلات الـ PCR بشكل متزامن. (real time) وتعد هذه الكيفية أكثر ارضاءاً من تحليل النواتج بعد عدد ثابت من الدورات. ان العائق الأساسي في استخدام صبغة بروميد الاثيديوم هو أن كلا النواتج المتخصصة وغير المتخصصة تولد اشارة. لقد تمكن الباحثون من التغلب على هذا باستخدام طرائق معتمدة على المجسات لتحليل تراكم النواتج. ان المجسات المستخدمة هي متعددات نيوكليوتيدية ذات صبغة متفلورة مراسلة  (reporter fluorescent dye) مرتبطة بنهاياتها من نوع 5' وصبغة خامدة (quencher dye) عند النهاية 3' . عندما يكون المجس كاملا، يعمل القرب من الصبغة الخامدة على اختزال التفلور الصادر من الصبغة المراسلة. وعندما يوجد التسلسل الهدف، يرتبط المجس بعد أحد مواقع البوادئ. وبامتداد البادئ، يتم شق المجس بفعالية 5'  exonuclease activity لانزيمpolymerase   Taq (شكل 2 ).

شكل (2): تفاعل real time PCR الكمي (تصميم المؤلف).

يعمل هذا الشق على فصل صبغة المراسل من الصبغة الخامدة، وبهذه الطريقة يزيد من اشارة الصبغة المراسلة. يقوم الشق بازالة المجس من الشريط الهدف، وهذا يسمح باستمرار امتداد البادئ الى نهاية الشريط البادئ. يتم شق جزيئات صبغية مراسلة اضافية من نظيراتها من الواسمات مع كل دورة، وهذا يؤثر في زيادة كثافة التفلور مقارنة بكمية الناتج المضخم. هذا وتم تطوير اجهزة تعمل على دمج التدوير الحراري ( thermal cycling) المعتاد مع قياس التفلور، وذلك لكي تمكن من متابعة تفاعل الـ PCR بشكل واقعي. وهذا هو الذي عمل ثورة في التقنيات المعتمدة على المعرفة الكمية لتفاعلات الـ PCR. اي ان التفاعلات يتم وصفها منذ الخطوة الأولى عند ملاحظة أول ناتج تضخيمي بدلاً من كمية الـ PCR المتراكمة بعد عدد ثابت من الدورات. وهذا يعني كلما كان عدد النسخ البادئة أكبر من التسلسل الهدف، كلما يتم كشف تفلور ملموس بصورة أقرب. ويتم معرفة كمية الهدف في العينات الغير معروفة بتحضير منحنى قياسي (standard curve) وذلك باستعمال نسخ بأعداد مختلفة من التسلسلات البادئة.

تم تطوير طريقة معينة تسمح بتعقب تفاعلات الـ PCR وذلك من خلال زيادة الاشعاع الصادر من المجسات المتفلورة fluorescent probes)) .ان الأجهزة التي لها القدرة على مزج تفاعل الـ PCR والكشف عن التفلور يمكن اجرائها في أنابيب زجاجية شعرية. وهذا يسمح باختراق الضوء لتنشيط ما يعرف بالفلوروفور (flourophore) وبمتابعة اشعاع التفلور اثناء اجراء تفاعل الـ PCR. ويمكن للأجهزة الحديثة متابعة عدة صبغات متفلورة مختلفة بشكل متزامن، سامحة باجراء عدة تفاعلات في أنبوب واحد. أما المجسات المتفلورة ذات الطبيعة الارتباطية بالـ DNA والتي يزداد تفلورها بعد الارتباط بالـ DNA فتوضع ضمن نفس خليط تفاعل الـ PCR .وبازدياد كمية الـ DNA الهدف الحديث التصنيع، يزداد ارتباط المجس بالـ DNA الهدف، ويزداد الاشعاع المتفلور بدوره. ان أبسط المجسات الارتباطية بالـ DNA هي ذات طبيعة غير متخصصة بتسلسل معين عند ارتباطها مع الـ DNA. وعلى سبيل المثال، صبغة SYR Green I ذات الاشعاع المتفلور عند الطول الموجي 520 نانوميتر. تتفلور هذه الصبغة حال ارتباطها بالـ DNA المزدوج فقط. تتعقب هذه الصبغة الكمية الكلية للـ DNA المزدوج الشريط ولكن ليس لها القابلية على أن تميز بين التسلسلات المختلفة. ولكي نتأكد بأن التسلسل الهدف الصحيح هو قيد التضخيم، يستخدم مجس متفلور متخصص بالتسلسل.

يمكن ضرب مثال لتوضيح الفكرة المناقشة في أعلاه، كما في المجس المعروف "بتاك مان" (TaqMan^® probe). ويتألف هذا المجس من اثنان من الصبغات المتفلورة (flourophores) مرتبطة بتسلسل DNA يزدوج في وسط الـ DNA الهدف. ويقوم نظام نقل الطاقة الرنيني المتفلور (fluorescence resonance energy transfer) أو FRET بنقل الطاقة من الصبغة المتفلورة ذات الطول الموجي الصغير في نهاية واحدة من الطول الموجي الكبير للصبغة المتفلورة للنهاية الأخرى. وهذا يخمد من تفلور اشعاع الموجة الصغيرة.

وخلال تفاعل الـ PCR ، يرتبط مجس TaqMan بالتسلسل الهدف بعد خطوة المسخ والتي تفصل شريطي الـ DNA. وبقيام انزيم Taq polymerase بمد البادئ خلال خطوة الـ PCR القادمة، فانه يقوم بالنهاية بالاصطدام بمجس TaqMan. هذا ولا يعتبر انزيم Taq polymerase هو الانزيم الوحيد القادر على ازاحة الأشريطة التي تعترض تقدمه الى الأمام، ولكنه يمتلك الفعالية الهاضمة nuclease activity 5' – 3' والتي تحطم شريط المجس المتكون من تسلسل DNA طبعاً. وهذا يحطم الرابطة بين الصبغتين المتفلورتين ويمزق الـ. FRET ان الصبغة المتفلورة ذات الطول الموجي الصغير هي الآن غير متعرضة للاخماد ويزداد تفلورها. وفي هذه الحالة، تتعلق الزيادة في التفلور بشكل مباشر بكمية التسلسل الهدف المتخصص الذي قد تم تضخيمه في هذه التقنية الكمية.

مواضيع ذات صلة

GENE TRANSCRIPTION

كيف نكشف عن هوية الشخص الجينية

طرق توسيم المجسات (labeling of probes) للكشف عن الجين الهدف

الـ PCR ذو البداية الحارة (hot start PCR)

Salt Effects on Protein-DNA Interactions

Structures of DNA-Binding Proteins

Secondary Structure Predictions

Calculation of Protein Tertiary Structure

RNA Heterogeneity

Nuclear Export of RNA

Regulation of RNA Processing: Capping, Splicing, and Polyadenylation

The Alpha Helix, Beta Sheet, and Beta Turn