لكي يضاعف الـ DNA ، يحتاج انزيم DNA polymerase لا الى القلب فقط ، وانما يحتاج الى البادئ primer ايضاً . ان البادئ هو تسلسل من DNA مفرد الشريط single stranded DNA والذي يتلدن anneal او يرتبط بالشريط القالب بواسطة ازدواج قاعدي متخصص. هذا ويمكن لجهاز مخلق النيوكليوتيدات الصغيرة oligonucleotide synthesizer أن ينتج بوادئ لأي تسلسل مرغوب . ان بوادئ تقنية الـ PCR هي تسلسلات قصيرة وعادة ما تكون بطول حوالي 15 الى 25 نيوكليوتيدة. إن تسلسلات هذه البوادئ الصغيرة هي التي تكون مسؤولة عن ذلك التخصص العالي في هذه التقنية. صمم الباحثون بوادئ يمكن لها أن ترتبط بالتسلسلات الواقعة على كلا جانبي التسلسل الهدف. لقد قاموا بذلك بواسطة جعل البوادئ مكملة للتسلسلات الهدف. وكذلك بواسطة جعلها طويلة كفاية لكي لا ترتبط بموقع آخر (شكل 1).

كلما كان البادئ طويلا ، كلما زادت احتمالية كون ذلك البادئ مكمل للتسلسل الهدف فقط دون غيره من التسلسلات وبما أن أي موقع مفرد في تسلسل الـ DNA من الممكن أن يحتله أما الأدنين أو الكوانين أو السايتوسين أو الثايمين، لذا، فهنالك احتمال من أربع احتمالات أن هذا الموقع سوف يحتوي على الأدنين على سبيل المثال. ان هذا على أساس التقريب لأنه لا يمكن للنيوكليوتيدات من أن تتوزع بشكل متساوي أو عشوائي في الـ DNA. ولهذا السبب، فان احتمالية وجود أي تسلسل معين من الـ DNA والذي طوله هو عدد معين من النيوكليوتيدات (n) في أي بقعة من تسلسل الـ DNA هي 1 إلى 4 . أن احتمالية أن تسلسل بطول 20 نيوكليوتيدة (وهو الطول النموذجي لبوادئ الـ PCR) في أن يوجد في أية منطقة معطاة من تسلسل الـ DNA بشكل عشوائي هو أقل من واحد إلى ترليون  10^-12. ويبلغ طول الجينوم البشري 3X10⁹ نيوكليوتيدة، وبالتالي، فان أي تسلسل بطول 20 نيوكليوتيدة من غير المحتمل أن يوجد لأكثر من مرة واحدة ربما في الجينوم البشري. صمم الباحثون اثنين من البوادئ التي يمكن لها أن ترتبط بالأشرطة المتعاكسة للـ DNA على كلا جانبي التسلسل الهدف. لقد صممت تلك البوادئ لكي "تصوب" على الطريق الصحيح، بحيث أن قطعة الـ DNA الواقعة بينها وليس خارجها هي التي تستنسخ .إن تصميم البوادئ لكي تصوب" على الهدف الصحيح ببساطة يحتاج إلى بنائها بحيث أن نهاياتها من نوع 3' تمتد نحو التسلسل الهدف، بينما تمتد نهاياتها ذات النوع 5' بعيداً عنه. تدعى أحد النهايات بالنهاية 5' بينما تدعى النهاية الأخرى بالنهاية 3'. وفي عملية التضاعف، تضاف النيوكليوتيدات عادة إلى النهاية 3' للشريط النامي من الـ DNA . وهكذا، تتقدم عملية تخليق الـ DNA بالاتجاه من 5'إلى 3'. وكما نوقش في الفصل الثالث، يكون شريطي الـ DNA المتكاملين متضادي الاتجاه anti-parallel، وهذا يعني بأنهما يسيران باتجاهين متعاكسين، لذا تم استغلال هذه الحقيقة لتكوين نواتج الـ PCR ذات الأطوال المحددة (شكل 1).

شكل (1) طريقة بدء سلسلة بوليمريز الدنا (PCR) لتضخيم تسلسلات نيوكليوتيدية معينة خارج جسم الكائن الحي. يتم تسخين الـ DNA المعزول من الخلايا لفصل الأشرطة المكملة لبعضها البعض. ثم تربط تلك الأشرطة بوجود كميات كبيرة من متعددات نيوكليوتيدية صغيرة والتي قد تخليقها كيميائياً لكي تكمل التسلسلات الهدف الموجودة في الأشرطة المكملة والمفصولة بالحرارة. تعمل تلك النيوكليوتيدات الصغيرة كبوادئ متخصصة لتخليق الـ DNA خارج جسم الكائن الحي والمحفز من قبل انزیم DNA polymerase ، والذي يقوم بتخليق الـ DNA بين موقعي البادئين الأمامي والخلفي (تصميم المؤلف).

تألف تفاعل الـ PCR النموذجي من عدة مكونات مختلطة مع بعضها البعض بمحلول ذو حجم 25 إلى 100 مايكروليتر. يجب أن يحتوي المحلول على الـ DNA القالب DNA template والبوادئ primers والنيوكليوتيدات nucleotides لكي تعمل كأحجار بناء building blocks للـ DNA المتكون حديثاً ، وإنزيم DNA polymerase الذي يحفز على تخليق الـ DNA ، بالإضافة إلى الدارئ buffer والأملاح salts، والتي تحتوي عادة على المغنيسيوم الضروري للفعالية المثالية لإنزيم DNA polymerase. هذا ويمكن أن يكون الشريط القالب غير نقي، كما في مسحة الـ DNA المأخوذة من مسرح الجريمة. ولكي نجري تفاعل الـ PCR ، يوضع الأنبوب المحتوي على المحلول في ماكنة تدعى بدوار الدنا الحراري DNA thermal cycler (شكل 2). إن الدوارات الحرارية أساساً هي كتل تسخين قابلة للبرمجة. إنها تحتوي عادة على كتلة سميكة من الألمنيوم مكونة من ثقوب والتي توضع فيها أنابيب تفاعل الـ PCR. يمكن لهذه الكتلة من أن تبرد أو تسخن بسرعة إلى درجات حرارية معينة ولأوقات معينة تحت سيطرة منظمة من جهاز الحاسوب. يتم السيطرة على كل دورة من تفاعل الـ PCR وذلك بواسطة تغيير حرارة كتلة الألمنيوم هذه، وبالتالي تتغير حرارة مزيج التفاعل.

شكل .(2) جهاز الدوار الحراري لتضخيم الجين ((PCR Thermocycler المصنع من قبل شركة ابندورف الألمانية ( Germany Eppendorf-) صمم هذا الجهاز بشكل محبب للباحث بحيث يمكن التحكم به عن طريق اللمس المباشر على شاشته (touch screen).

إن الخطوة الأولى في تفاعل الـ PCR هو تسخين المزيج إلى درجة حرارية عالية، عادة °94C إلى °95C ، لحوالي خمس دقائق. تنكسر الأواصر الهيدروجينية التي تحمل الشريطين المتقابلين مع بعضهما البعض في الحلزون المزدوج عند التعرض إلى تلك الدرجات الحرارية. وينفصل الـ DNA إلى أشرطة مفردة تدعى تلك العملية بالمسخ denaturation .

في الخطوة الثانية، يبرد مزيج الـ PCR إلى حرارة أوطأ، والتي تكون نموذجياً مابين °50C إلى °65C. إن هذا يسمح للبوادئ بأن ترتبط بتسلسلات DNA مكملة متخصصة في شريط الـ DNA القالب يتم اختيار درجة الحرارة في هذه الخطوة بعناية لكي تكون قليلة بشكل كاف لكي تسمح للبادئ من أن يرتبط ، ولكن ليس أبرد من تلك الدرجة. ربما تسمح درجات حرارة الارتباط الأقل للبوادئ بأن ترتبط بمناطق بشريط الـ DNA القالب والتي لا تكون مكملة لها بشكل كامل، وهذا من الممكن أن يؤدي إلى تضخيم تسلسلات غير متخصصة. ويمكن أن تحدد حرارة الارتباط المثالية لعدد من البوادئ من قبل الصيغة الكيميائية المعتمدة على المكون النيوكليوتيدي للبوادئ ، ولكنها مسألة تجريبية ( (try and error لكي نجد أفضل درجة حرارية للارتباط تستغرق خطوة ارتباط البادئ annealing step من 15 إلى 30 ثانية، وهو وقت قصير بشكل مدهش باعتبار أن البادئ يجب أن يمسح " تسلسلات الـ DNA بحثاً عن الشريط القالب.

في الخطوة الثالثة (شكل 3)، يسخن التفاعل من جديد، ليصل إلى °72C ، وهي الحرارة التي يكون فيها إنزيم DNA polymerase أكثر فعالية، تتحطم معظم الإنزيمات عند هذه الدرجة الحرارية، ففي الأيام الأولى من اكتشاف تقنية الـ PCR، استخدم العلماء إنزيم الـ DNA polymerase المشتق من بكتريا القولون Escherichia coli والذي يكون بفعالية أكبر عند درجة حرارة جسم الإنسان والتي هي °37C. ولكن إنزيمات بكتريا القولون قد تحطمت عند درجات الحرارة العالية المطلوبة لتفاعلات المسخ والربط، ولهذا فإن إنزيم الـ polymerase يجب أن يضاف من جديد في كل تفاعل خلال كل خطوة من خطوات الـ PCR.

ولحل هذه المشكلة، قام العلماء بتنقية إنزيمات DNA polymerases من الأحياء المجهرية التي تعيش في الينابيع الحارة، أو في الفجوات الحرارية العميقة في البحار. تكون إنزيمات هذه الكائنات أكثر فعالية في درجات الحرارة العالية إن أكثر إنزيم مستخدم في تقنية الـ PCR يدعى بـ DNA polymerase  Taq ، والذي قد تمت تنقيته أصلا من بكتريا الينابيع الحارة المعروفة بـ aquaticus Thermus في درجة حرارة °72C ، يضيف إنزيم DNA polymerase Taq النيوكليوتيدات إلى نهايات الـ 3' للبوادئ المرتبطة وبمعدل حوالي ألفين نيوكليوتيدة بالدقيقة الواحدة ولهذا السبب، ولكي نضخم التسلسل الذي هو بطول ألف نيوكليوتيدة، فإن خطوة امتداد البادئ يجب أن تدوم لثلاثين ثانية عند الدرجة الحرارية °72C. وبنهاية تلك الخطوة، يمتلك كل شريط قالب شريط مكمل جديد. إن هذا يكمل أول دورة من دورات الـ PCR يمكن أن تعاد الدورة، عند تلك النقطة، وذلك بواسطة إعادة خطوة المسخ من جديد.

في الخطوة التالية، يمكن أن يعمل شريطي الـ DNA من جديد كقوالب، كما سيحدث للشريطين المخلقين حديثاً. وبهذه الطريقة، تزدوج عدد من القوالب وهكذا تزدوج من جديد في كل خطوة PCR ناجحة .عند نهاية التضاعف، يحتوي أنبوب التفاعل على قطع DNA تكون معظمها عبارة عن نسخ من التسلسل الهدف. أن شريط الـ DNA القالب الأصلي مازال موجود، ولكنه يوجد بكميات مهملة مقارنة بكميات نواتج الـ PCR (شكل 3). هذا ويكشف عن كميات الـ DNA المضخمة في جهاز الدوار الحراري بالترحيل الكهربائي بالهلام عادة. ويمكن استخدام تقنية الاليزا ( enzyme linked immune adsorbent assay) مع بوادئ الـ PCR الموسومة بمادة غير اشعاعية كالبايوتين مثلا.

شكل (3). تضخيم الـ DNA باستخدام تقنية الـ PCR. ينتج الـ PCR كمية من الـ DNA يمكن تزدوج في كل دورة من دورات تخليق الـ DNA وتحتوي على أنواع DNA بأحجام متفردة. تتألف كل دورة من ثلاث خطوات، وهي المسخ والارتباط والبلمرة وبعد عدة دورات من التفاعل، يتسيد مزيج التفاعل ذو قطع الـ DNA المختلفة قطعة DNA مفردة، تبدأ بالبادئ الأمامي وتنتهي بالبادئ الخلفي. وفي هذا المخطط، تتوضح ثلاث دورات من التفاعل والتي هي كفيلة بانتاج 16 سلسلة من الـ DNA ، ثمان منها تمتلك الطول المحدد للقطعة الهدف (ذات اللون الأصفر)، ولكن بعد ثلاث دورات أخرى، يكون عدد تلك القطع ذات الطول المحدد هو 240 من أصل 256 سلسلة DNA (تصميم المؤلف).

مواضيع ذات صلة

The Alpha Helix, Beta Sheet, and Beta Turn

Structures within Proteins

كيف نعرف تسلسل الجين

Control of Gene Function and Biochemical Activity in Cells

آليات إصلاح الحمض النووي المتضرر DNA repair mechanisms

Hydrophobic Forces

Hydrogen Bonds and the Chelate Effect

Genes in the Cell Nucleus Control Protein Synthesis

RNA Proofreading

Regulation of Transcription by DNA Modification

Electrostatic Forces that Determine Protein Structure

A peptide bond